明視野顯微鏡下特異性區(qū)分斑馬魚視網(wǎng)膜細(xì)胞核的方法

付金玲，宋 丹，左 玲，鄒 賀，康治臣

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 1.眼科；2. 康復(fù)科，吉林 長春130041)

精確地計數(shù)視網(wǎng)膜細(xì)胞在時間和空間上的分布是研究視網(wǎng)膜發(fā)育及退變的基礎(chǔ)。每個視網(wǎng)膜細(xì)胞只有一個細(xì)胞核，因此最直接計數(shù)視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法是在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞核的數(shù)目。然而，由于視網(wǎng)膜的高核密度使直接核計數(shù)非常困難。這主要是源于光學(xué)顯微鏡垂直分辨率比水平分辨率低[1，2]。在明視野顯微鏡下精確地計數(shù)特定視網(wǎng)膜區(qū)域細(xì)胞分布情況的前提是能夠特異并敏感地染色薄組織切片細(xì)胞核。

上述需要可以通過整合JB-4塑膠樹脂包埋及福爾根反應(yīng)所完成。JB-4包埋基于乙二醇甲基丙烯酸酯聚合反應(yīng)[3-7]。因為聚合發(fā)生在單體的試劑滲透入生物樣本之后，因此JB-4包埋能夠很好地保持樣本形態(tài)。而且JB-4包埋后的組織非常堅硬，最薄可以得到0.5 μm的組織切片[8]。

目前主要使用四個基本類型的染料和試劑染色細(xì)胞核，它們分別是基于靜電結(jié)合、水解反應(yīng)、共價修飾以及免疫反應(yīng)的原理[9]。由Feulgen和Rossenbeck[10]發(fā)明的福爾根核染色方法，是基于Schiff試劑和醛基之間的一個共價反應(yīng)。

本文主要內(nèi)容是結(jié)合JB-4塑膠樹脂包埋和福爾根染色的方法來觀察斑馬魚視網(wǎng)膜細(xì)胞核。通過分析JB-4切片厚度、鹽酸水解程度及Schiff反應(yīng)條件對細(xì)胞核染色的影響，尋找一個最佳能夠敏感且特異染色斑馬魚視網(wǎng)膜細(xì)胞核的方法。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚飼養(yǎng)

AB和TU野生型斑馬魚在14 h光照/10 h黑暗交替循環(huán)的恒溫魚房培育飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 眼球固定、JB-4包埋及切片 在常溫下過夜固定野生型斑馬魚成魚眼球，JB-4包埋(Polysciences公司)，仔細(xì)觀察并不斷調(diào)整組織以達(dá)到正確的包埋方向，為判定不同切片厚度對細(xì)胞核觀察的影響，將JB-4包埋的組織用超薄切片機(jī)(Thermo Electron公司)切片，每個組織切片厚度分別為2 μm、3 μm、4 μm及6 μm。

1.2.2 福爾根染色 為找到最佳的鹽酸水解條件(濃度和時間)、Schiff反應(yīng)時間及洗滌耐受時間，分別進(jìn)行如下實驗：

①在常溫下將JB-4切片分別浸泡于裝有1N、2N、3N、4N及5N鹽酸的科普林氏玻片染色缸中，浸泡持續(xù)時間從30 min到過夜。將染色后的切片浸泡于蒸餾水中洗滌10 min去除剩余未水解的鹽酸。在常溫下將切片浸泡于Schiff試劑(Santa Cruz公司)中2 h。②將經(jīng)過3N鹽酸過夜處理的切片浸泡于Schiff試劑中30 min到5 h。③將經(jīng)過3N鹽酸過夜處理、Schiff試劑浸泡2 h的染色切片用流水沖洗30 s，再分別浸泡于蒸餾水中洗滌5 min、30 min及過夜。④將洗滌過的切片常溫空氣中干燥，蓋玻片下中性樹膠封片。

1.2.3 亞甲天藍(lán)II和核固紅染色 ①將2 μm厚的JB-4切片分別在常溫下浸泡于亞甲天藍(lán)II(Sigma-Aldrich公司)和核固紅(Trevigen公司)溶液中30 min。②為去除過量的染料，染色后的切片于常溫下用流水沖洗30 s并置于蒸餾水中分別脫染5 min、30 min及過夜。③洗滌過的切片常溫空氣中干燥，蓋玻片下中性樹膠封片。

1.2.4 明視野顯微鏡 使用奧林巴斯BX60顯微鏡PlanApo 60×/1,40和UplanApo 20×/0,80油鏡觀察結(jié)果，所有圖像均在同一暴露時間下用4.6版Spot軟件拍攝。每一種染色方法至少有10張不同的樣本被拍攝，然后經(jīng)肉眼篩選出可代表這一特定染色方法的圖片。

2 結(jié)果

2.1 福爾根染色鹽酸水解條件

福爾根染色鹽酸水解可以在多種條件下進(jìn)行。為找到適合于JB-4包埋的斑馬魚視網(wǎng)膜福爾根染色的最佳鹽酸濃度，將4 μm厚的JB-4切片在Schiff試劑處理之前分別用1N、2N、3N、4N及5N的HCl進(jìn)行不同時間的水解反應(yīng)。然后通過肉眼觀察粉紅色的深淺判斷福爾根染色程度。我們發(fā)現(xiàn)鹽酸濃度越高、浸潤時間越長，則染色程度越強(qiáng)；反之，鹽酸濃度越低、浸潤時間越短，則染色程度越弱。但低濃度的鹽酸可以通過延長浸潤時間而提高染色強(qiáng)度。因此，為滿足快速水解的需要，推薦將JB-4包埋的組織切片浸潤于5N鹽酸中45 min。另外，3N鹽酸過夜處理也足以獲得相同的染色效果。

2.2 福爾根染色Schiff反應(yīng)時間

Schiff 反應(yīng)是醛基與Schiff試劑之間的共價凝集反應(yīng)，Schiff反應(yīng)的持續(xù)時間也會影響粉紅色終產(chǎn)物的數(shù)量。因此，我們比較了3N鹽酸過夜處理的4 μm厚JB-4切片經(jīng)過不同時間Schiff浸潤后染色強(qiáng)度的變化。我們發(fā)現(xiàn)染色強(qiáng)度隨著Schiff浸潤時間的延長而增加，2 h染色最強(qiáng)。

2.3 切片厚度對細(xì)胞核可分辨度的影響

通過比較2 μm、3 μm、4 μm及6 μm厚的切片對福爾根染色及核邊界分辨度的影響，發(fā)現(xiàn)這三類切片的染色強(qiáng)度均足以看清視網(wǎng)膜各類細(xì)胞核。然而，切片越厚，相互重疊的臨近細(xì)胞核越多以致單個細(xì)胞核越難分辨(圖1A-D)。考慮到在切2 μm厚切片時，標(biāo)本經(jīng)常破碎，推薦使用3 μm厚切片以區(qū)分單獨的細(xì)胞核及觀察組織整體形態(tài)。

圖1組織切片厚度對細(xì)胞核可分辨度的影響。(A-D)在2μm組織切片(A)中單個細(xì)胞核比在3μm組織切片(B)、4μm組織切片(C)及6μm組織切片(D)中顯示出更清晰的核邊界。箭頭所指顯示臨近的細(xì)胞核相互重疊。(60×)

2.4 福爾根染色與亞甲天藍(lán)II、核固紅染色的區(qū)別

亞甲天藍(lán)II和核固紅是陽離子染料，它們通過與帶負(fù)電荷的分子間靜電結(jié)合而使組織染色。因為DNA分子是帶負(fù)電荷的，因此這兩種方法經(jīng)常用于染細(xì)胞核。但它們也能使其它帶負(fù)電荷的細(xì)胞質(zhì)分子染色，因此特異性低。通過比較2 μm厚的JB-4切片福爾根染色與亞甲天藍(lán)II及核固紅對細(xì)胞核的染色，發(fā)現(xiàn)亞甲天藍(lán)II及核固紅均產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性細(xì)胞質(zhì)染色，很難分辨單一的視網(wǎng)膜細(xì)胞核。由于視錐細(xì)胞核本身染色弱，使得區(qū)分視錐細(xì)胞核染色及細(xì)胞質(zhì)染色變得更加困難。我們試圖通過增加脫染時間而減弱細(xì)胞質(zhì)染色背景。但過度的脫染洗滌時間并不奏效，因為這樣既減弱了細(xì)胞核信號又減弱了細(xì)胞質(zhì)信號。實驗結(jié)果顯示經(jīng)過30 min洗滌后細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色均變得非常微弱；過夜洗滌后，染色幾乎完全消失。而相比之下，共價反應(yīng)的福爾根細(xì)胞核染色可耐受過度的洗滌。因此，盡管福爾根染色操作相對需要更長時間，但它較亞甲天藍(lán)II及核固紅染色更特異及穩(wěn)固。

3 討論

福爾根染色是基于兩個基本的化學(xué)反應(yīng)[11,12]。首先，鹽酸水解打破DNA分子堿基與脫氧核糖之間的結(jié)合，從而在脫氧核糖的一端生成了醛基。其次，DNA水解產(chǎn)生的醛基與Schiff試劑發(fā)生凝集反應(yīng)產(chǎn)生粉紅色含有醌基的化合物，粉紅色化合物的多少與DNA分子的數(shù)量密切相關(guān)[11-13]。當(dāng)生物樣本包埋于JB-4塑膠樹脂中，JB-4基質(zhì)將阻止化學(xué)試劑的滲透從而減慢以上所述的化學(xué)反應(yīng)。因此，與薄切片相比，盡管厚的JB-4切片包含更多的DNA，但對于福爾根染色而言，化學(xué)反應(yīng)的減少表明染色強(qiáng)度可能不和切片厚度成正比。除此之外，厚切片由于光學(xué)顯微鏡垂直分辨率的局限性會破壞圖像質(zhì)量[1]。因此，為了更好地觀察斑馬魚視網(wǎng)膜細(xì)胞核，需要尋求一個染色信號強(qiáng)度與圖像分辨率之間的平衡。綜上，我們系統(tǒng)地研究了鹽酸水解、Schiff反應(yīng)及JB-4切片厚度如何影響斑馬魚視網(wǎng)膜細(xì)胞核的福爾根染色。

通過以上實驗結(jié)果，我們得出了一個最佳福爾根染色方法。它可以用于觀察JB-4包埋的斑馬魚視網(wǎng)膜細(xì)胞核及組織形態(tài)。方法如下:①在常溫下固定斑馬魚眼球于4%多聚甲醛溶液中過夜。②將固定后的眼球包埋于JB-4 樹脂中。③3 μm厚的切片用于觀察細(xì)胞核整體結(jié)構(gòu)。④收集切片于載玻片上。⑤在常溫下將JB-4切片經(jīng)3N鹽酸過夜處理或5N鹽酸浸潤45 min以水解DNA 分子。⑥將切片用蒸餾水洗滌10 min以去除過多的鹽酸。⑦在常溫下將經(jīng)鹽酸水解的JB-4切片于Schiff試劑中浸潤2 h。⑧將切片用流水沖洗30 s，再用蒸餾水洗滌5 min以去除過多的Schiff試劑。⑨蓋玻片下中性樹脂封片，顯微鏡照相。

這個簡單可靠的染色方法可以用于細(xì)胞計數(shù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Bertero M, De Mol C.Super-resolution by data inversion[J].Progress in Optics, 1996, 36:129.

[2]Lauer V.New approach to optical diffraction tomography yielding a vector equation of diffraction tomography and a novel tomographic microscope[J].J Microsc, 2002, 205:165.

[3]Higuchi S, Suga M, Dannenberg A M,et al.Histochemical demonstration of enzyme activities in plastic and paraffin embedding tissue sections[J].Stain Tech,1979, 54:5.

[4]Cole MB.Glycol methacrylate embedding of bone and cartilage for light microscopic staining[J].J Microsc, 1982, 127:139.

[5]Helander KG.Thickness variations within individual paraffin and glycol methacrylate sections[J].J Microsc, 1983,132:223.

[6]Ladekarl M.The influence of tissue processing on quantitative histopathology in breast cancer[J].J Micros, 1994, 174:93.

[7]Miller PL,Meyer TW.Methods in laboratory investigation.Effects of tissue preparation on glomerular volume and capillary structure in the rat[J].Lab Invest,1990, 63:862.

[8]Bancroft J D, Gamble M.Theory and practice of histological Techniques[M].6th ed.London:Churchill Livingstone, 2008.

[9]Kiernan J A.Histological and histochemical methods:theory and practice[M].4th ed.Oxford, UK:Scion, 2008.

[10]Feulgen R, Rossenbeck H.Mikroskopisch-chemischer Nachweis einer Nukleins?ure von Typus der Thymonukleins?ure und die darauf beruhende selective F?rbung von Zellkernen in mikroskopischen Pr?paraten[J].Hoppe-Seylers Z Physiol Chem,1924, 135:203.

[11] B?hm N, Sprenger E.Fluorescence cytophotometry:a valuable method for the quantitative determination of nuclear Feulgen-DNA[J].Histochemie, 1968, 16:100.

[12] Duijndam WAL,Van Duijn P.The influence of chromatin compactness on the stoichiometry of the Feulgen-Schiff procedure studied in model films.II.Investigations on films containing condensed or swollen chicken erythrocyte nuclei[J].J Histochem Cytochem,1975, 23:891.

[13] B?cking A, Giroud F, Reith A.Consensus report of the ESACP task force on standardization of diagnostic DNA image cytometry[J].Anal Cell Pathol,1995, 8:67.