聯合應用氯喹增加人膠質瘤細胞U343細胞對Bcl-2抑制劑ABT737的敏感性

趙金川 ，趙 燕 ，侯 坤 ，張 揚 ，牟 榮 ，柳敬偉*

(1.吉林大學第一醫院二部 神經外科， 吉林 長春130031；2.吉林省人民醫院 神經內科，吉林 長春130021；3.吉林金域醫學檢驗所有限公司)

Bcl-2抑制劑是一種新型的很有應用前景的抗腫瘤藥物，它通過抑制促存活Bcl-2家族蛋白的表達誘導腫瘤細胞凋亡。近年來,ABT-737、ABT-263、棉酚、apogossypol、TW-37、obatoclax、HA14-1等Bcl-2小分子抑制劑已成為研究的熱點，臨床前試驗表明該類藥物單藥對某些腫瘤有效，與放化療聯合使用具有明顯的協同效果[1]。 Bcl-2抑制劑可模擬僅有BH3結構域蛋白的功能，其中ABT-737已進入二期臨床階段，它在體外表現出與Bcl-xL、Bcl-2 和Bcl-w 有較高親和力[2]，而對Bcl-B、Bfl-1、Mcl-1親和力較低[3]。ABT-737表現出較強的單藥活性，尤其是對白血病，淋巴瘤，小細胞肺癌，但是也經常出現耐藥[4-5]。研究發現，Mcl-1在早期不能被靶向，因而導致ABT-737耐藥，但是ABT-737與其它的抗腫瘤藥物聯用可以增加腫瘤細胞死亡[6]。

目前，累積的證據表明氯喹可提高癌癥細胞對放療和化療藥物的敏感性，氯喹傳統上用于治療或預防瘧疾，機制是通過堿化溶酶體酸性環境，抑制其蛋白酶活性[7]。氯喹也可通過其免疫抑制特性用于自身免疫性疾病，但是其抗腫瘤機制尚不清楚[8，9]。因此，本研究擬考察ABT-737和氯喹兩種不同機制的抗腫瘤藥物聯用對人膠質瘤細胞U343細胞殺傷效應，以及二者應用是否具有協同作用。

1 材料與方法

1．1 主要試劑與儀器

氯喹(Chloroquine，CQ),Bcl-2抑制劑ABT737，四甲基偶氮唑藍(MTT)均購自美國Sigma公司,RPMI 1640，胎牛血清購自美國Gibco公司。

1．2 細胞株與細胞培養

人膠質瘤細胞U343細胞購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所，培養于含 10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和40 U/ml慶大霉素的RPMI1640培養基中，當細胞生長至對數生長期時進行實驗。

1.3 MTT法檢測細胞活性

將U343細胞以5×103/ml密度接種于96孔板(每孔加200 μl)，培養至對數生長期(24 h)，加入不同濃度藥物處理24 h后，小心吸去上清，加入90 μl新鮮培養液，再加入10 μl MTT溶液，繼續培養4小時，棄上清，每孔加入100 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。用酶標儀于490 nm波長處測定吸光度(A)值。按下式計算細胞存活率，細胞存活率 (%) = [A實驗孔-A空白孔/(A對照孔-A空白孔)]×100%，實驗重復 3次。

1.4 western檢測蛋白表達

U343細胞經藥物處理24 h后，加入細胞裂解液RIPA裂解，進行SDS-PAGE電泳。分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%，電轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3、細胞色素C(cytochrome c)抗體(Cell Signaling公司，1∶800)4℃孵育過夜，TBST洗3次膜，每次15 min，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(Cell Signaling公司1∶5000)室溫孵育2 h，TBST洗3次膜，每次15 min，ECL顯影。

1.5 統計學方法

采用 SPSS16．0軟件進行統計學分析。數據以M±SD表示 ，均數差別顯著性檢驗采用單因素方差分析，多組均數間比較采用最小顯著差數(LSD)法檢驗，P<0．05有統計學意義。

2 結果

2.1 ABT737對U343細胞生存率的影響

U343細胞經過10 μM、20 μM、30 μM ABT737處理24 h后，細胞生存率均顯著下降，并呈濃度依賴性(如圖1)。結果表明，ABT737具有降低U343細胞生存率的作用。

* 代表與對照組相比較有統計學差異

2.2 ABT737對U343細胞凋亡通路相關蛋白表達水平的影響

western blot檢測U343細胞凋亡通路執行蛋白caspase-3及其底物PARP，結果如圖2A和2B所示，與對照組相比Cleaved caspase-3和Cleaved PARP呈劑量依賴性的表達增加。另外，如圖2C所示cytochrome-c的表達量明顯增加，與空白對照相比較差異具有顯著性。以上結果表明ABT737可以激活凋亡通路，誘導U343細胞發生凋亡。

* 代表與對照組相比較有統計學差異

* 代表與對照組相比較有統計學差異

* 代表與對照組相比較有統計學差異

2.3 ABT737聯合應用氯喹對U343細胞生存率的影響

為考察聯用氯喹對ABT737誘導凋亡的協同作用，首先應用MTT法確定了氯喹對U343細胞的安全劑量，如圖3A所示，在20 μM劑量范圍內，氯喹對細胞活性無顯著影響。然而，當10 μM氯喹與20 μM ABT737共同作用24 h后，MTT結果如3B顯示，與對照組相比，二者單用均明顯降低U343細胞活性。二者聯用與單用ABT737組相比，細胞活性顯著降低。結果提示，氯喹和ABT737聯合應用具有協同作用，可更進一步降低細胞生存率。

2.4 ABT737聯合應用氯喹對U343細胞凋亡通路相關蛋白表達水平的影響

western blot檢測結果如圖4A和4B所示，氯喹組與對照組相比，Cleaved caspase-3和Cleaved PARP表達水平沒有明顯改變。而氯喹與ABT737聯用組與單用ABT737組比較，Cleaved caspase-3和Cleaved PARP表達水平明顯增加。同樣，氯喹組的cytochrome-c表達水平與對照組相比無明顯改變，而氯喹與ABT737聯用組與單用ABT737組比較，cytochrome-c表達水平顯著增加(見圖4C)。結果表明，聯合應用氯喹可以明顯增加ABT737引起的人膠質瘤細胞U343細胞凋亡。

圖3A 不同濃度氯喹對U343細胞生存率的影響

*與對照組相比有統計學差異，&與ABT737組相比有統計學差異

圖3BABT737聯合應用氯喹對U343細胞生存率的影響

3 討論

對于惡性腫瘤細胞，細胞凋亡可以快速使細胞數量損失，而且可以導致腫瘤生長緩慢[10]。目前，諸多抗癌藥物的研發圍繞誘導癌細胞凋亡，當“凋亡程序”受到破壞后，治療的敏感性降低[11]。而且研究發現，惡性神經膠質瘤的主要特點是對經典的caspase依賴的凋亡途徑產生抵抗[12，13]。之前的研究發現ABT737可以誘導癌癥細胞凋亡[14]，在本研究中，我們同樣發現ABT737可以引起人膠質瘤細胞U343細胞發生線粒體通路介導的凋亡。

*與對照組相比有統計學差異，&與ABT737組相比有統計學差異

圖4AABT737聯合應用氯喹對U343細胞CleavedPARP的影響

圖4B ABT737聯合應用氯喹對U343細胞Cleaved caspase-3的影響

*與對照組相比有統計學差異，&與ABT737組相比有統計學差異

氯喹具有增加抗癌藥物敏感性的作用[15]，而且，正在進行的臨床試驗也提示氯喹可能會對現行的癌癥治療策略產生深遠的影響[16]，本研究中我們發現聯合應用氯喹可以明顯增加ABT737引起的人膠質瘤細胞U343細胞凋亡。但是，氯喹的毒性不容忽視。所以，本實驗中通過MTT法選用了對癌細胞不產生顯著影響的劑量作為安全劑量，在此劑量下，氯喹表現出明顯的藥物協同作用。

綜上所述，小分子Bcl-2抑制劑ABT737聯合小劑量氯喹通過誘導人膠質瘤細胞U343細胞凋亡顯著提高ABT737的化療敏感性,這為臨床治療癌癥及其他腫瘤提供了一種新的思路和方法，而氯喹發揮這種作用的具體分子機制還需要進一步研究。

參考文獻：

[1]張淑蘭,姚鵬,宮 平.Bcl-2蛋白小分子抑制劑的研究進展[J].沈陽藥科大學學報,2008(11):919.

[2] Tilman Oltersdorf,Steven W Elmore,Alexander R Shoemaker,et al.An Inhibitor of Bcl-2 Family Proteins Induces Regression of Solid Tumours[J].Nature,2005,435(7042):677.

[3] RW Rooswinkel,B Van de kooij,M Verheij,et al.Bcl-2 Is a Better Abt-737 Target Than Bcl-xl Or Bcl-w and Only Noxa Overcomes Resistance Mediated By Mcl-1,Bfl-1,Or Bcl-b[J].Cell Death & Disease,2012,3(8):0.

[4] Marina Konopleva,Rooha Contractor,Twee Tsao,et al.Mechanisms of Apoptosis Sensitivity and Resistance to the Bh3 Mimetic Abt-737 in Acute Myeloid Leukemia[J].Cancer Cell,2006,10(5):375.

[5] Derek Yecies,Nicole E Carlson,Jing Deng,et al.Acquired Resistance to Abt-737 in Lymphoma Cells That Up-regulate Mcl-1 and Bfl-1[J].Blood,2010,115(16):3304.

[6] Mark S Cragg,Claire Harris,Andreas Strasser,et al.Unleashing the Power of Inhibitors of Oncogenic Kinases Through Bh3 Mimetics[J].Nature Reviews Cancer,2009,9(5):321.

[7] 李曉升.評述氯喹的作用機制假說[J].中國人獸共患病雜志,1999,15(4):101.

[8] CA Homewood,DC Warhurst,W Peters,et al.Lysosomes,Ph and the Anti-malarial Action of Chloroquine[J].Nature,1972,235(7):50.

[9] Andrew FG Slater.Chloroquine:Mechanism of Drug Action and Resistance In< I> Plasmodium Falciparum [J].Pharmacology & Therapeutics,1993,57(2):203.

[10]John FR Kerr,Clay M Winterford,Brian V Harmon.Apoptosis.Its Significance in Cancer and Cancer Therapy[J].Cancer,1994,73(8):2013.

[11] Clemens A Schmitt,Scott W Lowe.Apoptosis and Therapy[J].The Journal of Pathology,1999,187(1):127.

[12] Oliver B?gler,Michael Weller.Apoptosis in Gliomas,and Its Role in Their Current and Future Treatment.[J].Frontiers in Bioscience:a Journal and Virtual Library,2002,7(3):1.

[13] Joachim P Steinbach,Michael Weller.Apoptosis in Gliomas:Molecular Mechanisms and Therapeutic Implications[J].Journal of Neuro-oncology,2004,70(2):245.

[14] Hayato Takeuchi,Yasuko Kondo,Keishi Fujiwara,et al.Synergistic Augmentation of Rapamycin-induced Autophagy in Malignant Glioma Cells By Phosphatidylinositol 3-kinase/protein Kinase B Inhibitors[J].Cancer Research,2005,65(8):3336.

[15] Tomonori Kimura,Yoshitsugu Takabatake,Atsushi Takahashi,et al.Chloroquine in Cancer Therapy:a Double-edged Sword of Autophagy[J].Cancer Research,2013,73(1):3.

[16] Ravi K Amaravadi,Jennifer Lippincott-schwartz,Xiao-Ming Yin,et al.Principles and Current Strategies for Targeting Autophagy for Cancer Treatment[J].Clinical Cancer Research,2011,17(4):654.