Sm3+標記抗心磷脂抗體IgM時間分辨熒光免疫分析法的建立

沈洪遠，張 健，胡志剛*，葉 燕

(1.無錫市第二人民醫院 檢驗科，江蘇 無錫214023；2.南京醫科大學附屬無錫人民醫院 檢驗科)

抗心磷脂抗體(anticardiolipin antibody，ACA)常見于系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎等自身免疫性疾病，與血栓形成、自然流產或宮內死胎關系密切[1-4]。在自身免疫反應過程中，ACA的變化以IgG和IgM為主[5]。目前對ACA的檢測主要方法為酶聯免疫分析法[3,6]。酶聯免疫分析為大分子有活性的酶標記，在靈敏度、線性范圍和穩定性方面有所欠缺，此外，測量精度也不夠高，臨床上經常發現病人具有抗磷脂綜合征(A ntiphoaphulipids vndrome,APS)的癥狀但抗心磷脂抗體陰性[7-9]。建立靈敏、穩定、線性范圍寬、便捷的ACA檢測方法有重要臨床意義。本試驗采用ACA抗原(心磷脂+β2 糖蛋白I)和Sm3+標記的兔抗人IgM抗體，建立穩定的高靈敏度的時間分辨熒光免疫(time-resolved fluoroimmunoassay， TRFIA)法檢測人血清中的心磷脂抗體，報告如下。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑全自動TRFlA檢測儀AutoDELFIA-1235為美國Perkin-Elmer公司產品； ACA酶聯免疫試劑盒、ACA-IgG抗體標準品為德國AESKU公司產品；人重組β2 糖蛋白I、心磷脂、兔抗人IgM為美國sigma公司產品，Sm3+標試劑和Sm3+發光增強液購自美國Perkin-Elmer公司；N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(DTTA)為德國Sigma公司產品；牛血清白蛋白(BSA)購自衛生部上海生物制品研究所；96孔微孔板為國產聚苯乙烯板，經羧基化處理；Sephadex-G25為美國Pharmacia公司產品。其他試劑均為國產分析純。

1.2固相抗原制備將ACA抗原(人重組β2 糖蛋白I+心磷脂)用50 mmoL/L Na2CO3-NaHCO3pH 9.6緩沖稀釋制成包被液，96孔微孔板各孔加100 μl，4℃包被過夜。棄去包被液，沖洗3次，每孔加250 μl 含3 g/L BSA的上述緩沖液封閉，室溫放置2 h。棄去封閉液，拍干后真空抽干，板條密封后置-20℃冷凍保存。

1.3Sm3+標記抗體的制備Sm3+-兔抗人IgG抗體參照Sm3+標記盒說明書操作。取兔抗人IgM抗體l ml，經PD-10柱轉換緩沖條件，洗脫液為含0.155 moL/L NaCl 的50 mmoL/L Na2CO3-NaHCO3pH 8.5緩沖液。收集蛋白峰，濃縮至2 g/L。取500 μl加入含0.2 mg的Sm3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Sm3+-DTTA)凍干粉的小瓶中，25℃磁力攪拌反應20 h。反應液經用80 mmoL/L tris-HCl pH 7.8緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱(1×40 cm)層析，全自動TRFlA檢測儀檢測，收集蛋白峰，稀釋后分裝凍干保存。

1.4ACA-IgM抗體的測定采用二抗間接法，加用稀釋液稀釋的血清100 μl 到板條中，25℃振蕩反應30 min 后，洗滌4次，然后加分析緩沖液稀釋的Sm3+-兔抗人IgM抗體100 μl，25℃振蕩反應30 min后，洗滌6次，再加200 μl 增強液振蕩5 min，在AutoDELFIA-1235儀上檢測熒光信號。最后從標準曲線計算樣品中的ACA-IgM抗體的含量。

1.6統計學分析采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。2種方法檢測結果的一致性檢驗采用相關性分析，并計算相關系數。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1Sm3+標二抗的理化和免疫學鑒定Sm3+標記兔抗人抗體經sephadex G-25層析，收集第1洗脫峰，見圖1。

注：第1洗脫峰收集的蛋白代表Sm3+標記兔抗人IgM抗體圖1 TRFIA檢測sephadex G-25洗脫峰

2.2ACA-IgM抗體-TRIFIA的考核數據處理得到ACA-IgM-TRIFIA的標準曲線，如圖2所示。x軸代表熒光強度，y軸代表ACA-IgM抗體的濃度(5個標準點的濃度別為4.85、19.4、77.6、310.4、1241.6 MPL U/ml)，結果顯示劑量-反應曲線呈良好線性相關。

圖2 ACA-IgM抗體-TRIFIA的標準曲線

2.3精密度評價將低、中、高3份血清樣品，同時采用TRFIA法檢測，進行批內和批間精密度測試。見表1，2。

表1 批內精密度測試(濃度：MPL U/ml，n=20)

表2 批間精密度測試(濃度：MPL U/ml，n=8)

2.5回收率3份已知濃度標本倍比稀釋回收率見表3，最低為93.69%，最高為109.06%，均值為101.14%。

2.6相關性實驗25例病人血清樣品(ACA-IgM抗體濃度范圍在4.05-126.1 MPL U/ml)，分別用TRFIA和ELISA 2種方法所測結果的相關系數為0.78，呈高度相關，見圖3。

表3 3份已知濃度標本倍比稀釋回收率

圖3 TRFIA和ELISA相關性分析

2.7檢測范圍比較將1份 ACA-IgM抗體強陽性的血清標本從2483 MPL U/L倍比稀釋至0.151 MPL U/L，ELISA方法較好的線性范圍在4.85-310.4 MPL U/L，而TRFIA方法在0.151-2483 MPL U/L都有較好的線性，見圖4。

圖4 ELISA和TRFIA檢測范圍比較

2.8臨床特異度采用自制TRFIA試劑檢測50例健康獻血者血清中的ACA-IgM抗體，陰性49份，陽性1份，特異度為98%。

2.9穩定性試驗將TRFIA法和ELISA法試劑盒置于37℃水浴箱7天，再與正常保存的試劑盒做對比(同時進行20例ACA-IgM抗體陽性血清的檢測，計算吸光度和熒光計數值的均值)，見表4。TRFIA法結合率僅下降14.7%，而ELISA法結合率下降37.6%，說明TRFIA法試劑盒穩定性較好。

表4 BAS-TRFIA法和ELISA法穩定性比較

3 討論

當前，檢測ACA 多采用ELISA 法，臨床上經常發現病人具有抗磷脂綜合征的癥狀但抗心磷脂抗體陰性，ELISA方法存在靈敏度低、線性范圍窄、酶標記物不穩定等諸多問題。時間分辨熒光免疫分析技術是近幾年快速發展起來的新技術，具有零本底、靈敏度高、重復性好、特異性強、線性范圍寬等特點。標記離子螯合物產生的熒光強度高，壽命長，有利于消除樣品及環境中熒光物質對檢測結果的影響。每一秒鐘檢測樣品1000次，結果取平均值，有利于提高檢測的準確性[10-12]。TRFIA被廣泛用于C反應蛋白[13]、水痘-帶狀皰疹病毒-IgG抗體[14]、乙型肝炎病毒前S1抗原[12,15]、抗環瓜氨酸肽段抗體[7]、人巨細胞病毒 IgM抗體[8]等的檢測。

在以往ELISA法檢測ACA過程中，我們也發現有大量ACA弱陽性及臨界值的存在，加上準確性和重復性欠佳，給臨床診斷這部分患者的自身免疫性狀況帶來了影響。而本試劑盒靈敏度達到0.1 MPL U/ml，遠低于正常參考上限6.93 MPL U/ml，且高、中低3個濃度批內、批間CV均小于10%，從而能夠很好地解決這一問題。50例健康獻血員血清樣本進行ACA的檢測，特異性98%，說明本系統不僅靈敏度高，特異性也好。圖3結果顯示，與進口ELISA試劑相比，2種方法所測結果的相關系數為0.956，呈高度相關，一致性較高，表明在ELISA線性良好的范圍內二種方法檢測結果高度一致，證明我們建立的TRFIA法結果可靠。將TRFIA法和ELISA法試劑盒置于37℃水浴箱7天，再與正常保存的試劑盒做對比,TRFIA法結合率僅下降14.7%，而ELISA法結合率下降37.6%，說明TRFIA法試劑盒穩定性較好。

檢測范圍比較試驗顯示，將一強陽性標本從2483 MPL U/L倍比稀釋至0.151 MPL U/L，ELISA方法較好的線性范圍在4.85-310.4 MPL U/L，而TRFIA方法在0.151-2483 MPL U/L都有較好的線性，具有很寬的量程。這是由ELISA法和TRFIA法的檢測技術范圍所決定的，從圖4我們發現ELISA法檢測ACA-IgM的檢測反應信號(吸光度變化范圍)從0.05-2.5之間(最低點至最高點只有50倍)，而TRFIA法檢測ACA-IgM的檢測反應信號(熒光計數值變化范圍)從40-80000之間(最低點至最高點有2000倍以上的差異)，TRFIA的檢測范圍比ELISA提高40倍。

目前，時間分辨熒光免疫分析儀在國內已較普遍使用，儀器全自動操作，誤差減少，操作流程短。銪標記兔抗人IgM抗體的制備經專業人員培訓后可成功標記，儲存時間長、無放射性污染。進口或國產的ACA-IgM抗體商品試劑盒在2500圓左右，每份標本的檢測成本約30圓，而本實驗室建立的TRFIA法檢測ACA-IgM抗體的成本在10元左右，有價格優勢。基于以上幾個方面，TRFIA法定量檢測ACA抗體的方法有望普遍應用。

總之，利用TRFIA方法定量檢測 ACA-IgM 抗體具有檢測范圍寬，試劑盒穩定性好、靈敏度高、特異度好等優點，在自身免疫性疾病診治、治療監測及預后判斷具有重要意義。

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