油酸制作ARDS犬模型及CT表現

李雯，陳淮，曾慶思，劉奇，劉琴，蒙秋華

·實驗研究·

油酸制作ARDS犬模型及CT表現

李雯，陳淮，曾慶思，劉奇，劉琴，蒙秋華

目的探索利用油酸制作犬急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)模型的方法及CT評價犬ARDS的價值。方法將16條健康比格犬隨機分為模型組(A組，12條)和對照組(B組，4條)，A組在30 min內從深靜脈緩慢注入0.18 mL/kg油酸(用0.9%生理鹽水30 mL稀釋)造模，當犬動脈血氧分壓(PaO2)/吸入氧分數值(FiO2)≤200 mmHg和肺動脈楔壓(PCWP)≤18 mmHg時，即認定犬ARDS成模；B組僅從深靜脈注入相同容量的0.9%生理鹽水。兩組在造模前及造模后均行CT掃描。在CT掃描結束后對犬實施安樂死，取出肺組織觀察大體標本及鏡下情況，并計算肺濕干比重 (W/D)。結果A組在油酸注射(90±10) min后形成ARDS模型，其肺濕干比重為10.42±0.74 ，與B組(5.33±0.75)比較差異有統計學意義(P<0.05)；犬ARDS鏡下表現為肺水腫、炎性細胞滲出及透明膜形成，而兩肺彌漫分布磨玻璃密度影則為犬ARDS 的典型CT表現。結論利用油酸能較好地制作犬ARDS模型，CT能有效監測犬ARDS的形成。

急性呼吸窘迫綜合征；狗；油酸；體層攝影術，X線計算機

急性肺損傷(acute lung injury，ALI) /急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)指由于心源性以外的各種肺內、肺外因素造成的急性、進行性缺氧性呼吸衰竭，其臨床表現為呼吸窘迫和難以糾正的低氧血癥，治愈率較低；臨床往往急性發病且情況危急，處理不及時，病死率高。CT檢查受到搬運路途中病情危險的限制，臨床上主要行床旁照片影像檢查。臨床對ARDS的很多研究是在動物ARDS模型上進行的，根據模型研究該病病理生理變化過程以及治療方案[1]。多數實驗證實犬的ARDS標準與人類相同[1]。本研究采用油酸對比格犬進行ARDS模型制作，旨在了解犬ARDS的CT影像表現。

材料與方法

1.實驗準備

16條實驗動物比格犬均由廣州醫藥工業研究院提供，且通過了廣州醫學院的醫學倫理會批準，雌雄不分，未孕，體重10～14 kg，其中隨機12條為實驗組(A組，即模型組)，另4條為對照組(B組)，采用呼吸機(EVITA 4，德國)控制犬的呼吸，犬的吸氧濃度為50%，呼吸時比為1:2，呼吸頻率為25～40次/分。

2.麻醉和外科準備

實驗犬在實驗開始前禁食禁飲12 h，用100 mg氯胺酮、10 mg咪達唑侖、0.25 mg阿托品肌肉注射誘導麻醉后，喉鏡引導下向氣管內插入內徑為7.5 mm的氣管插管建立呼吸通道[2]，用刺針經皮刺入動物右側股靜脈，插入導絲引入8F單腔導管鞘建立靜脈通道，該通道用來確保實驗過程中動物麻醉、輸液和血流動力學測定。實驗過程中從中心靜脈持續靜滴生理鹽水50 ml/h，間斷用稀釋的肝素溶液沖洗管道系統，保持管道的通暢。持續從中心靜脈管靜脈注射5～10 mg/kg/h丙泊酚和0.25～0.50 mg/kg/h維庫溴胺(推針泵SN-50C6，深圳)維持麻醉。向右側股靜脈導管鞘內插入施旺甘氏導管(愛德華茲生命科學，加利福尼亞州)，用來測量肺動脈楔壓(pulmonary arterial wedge pressure，PCWP)。左側股動脈以右側股靜脈同樣的方法置入4F PiCCO管，用來檢測動脈血壓、中心體溫和血管外肺水的情況，并通過該通道采集動脈血的標本用來進行血氣分析(使用i-STAT Abbott,Illinois)。

3.CT掃描設備及參數

本實驗采用西門子128層螺旋CT進行掃描，掃描采用從肺尖至膈頂模式，掃描參數：128×0.6 mm，轉速0.5 s/r，視野180 mm×180 mm，管電壓120 kV，管電流一般為35 mAs，螺距1.2，像素尺寸0.32×0.32，采集矩陣512×512。掃描完成后對掃描原始數據進行圖像重建，重建層間距、層厚為2 mm。

4.急性肺損傷模型構造及CT掃描

A組(模型組)根據犬的重量按0.18 ml/kg的油酸計算注入靜脈量，用0.9%生理鹽水30 ml稀釋油酸，然后通過中心靜脈管在30 min內注射[3，4]。 B組用0.9%生理鹽水代替油酸，根據犬的重量按0.18 ml/kg的0.9%生理鹽水加上0.9%生理鹽水30 ml的量注入，用相同的方法注射入犬的體內。兩組動物均采用仰臥位姿勢。所有動物在實驗前均采集動脈血進行血氣分析、肺毛細血管楔壓的測量和分別行CT胸部掃描，注入油酸后每隔10 min采集動脈血進行血氣分析，直至A組犬動脈血氧分壓(PaO2)/ 吸入氧分數值(FiO2)≤200 mmHg后，再對兩組犬分別采集動脈血進行血氣分析和PAWP的測量，A組實驗后CT掃描時機：當犬PaO2/FiO2≤200 mmHg和PAWP(肺毛細血管楔壓)≤18 mmHg時，即認定犬達ARDS狀態[3]。B組CT掃描時機與A組平均時間相同。

實驗中觀察犬的呼吸情況，當A組PaO2/FiO2≤200 mmHg且吸氧后未見改善視為達到ARDS模型要求，對犬進行CT掃描，用0.1 mL維庫溴銨靜脈注射，阻滯犬的自主呼吸，隨即用呼吸機給犬以35 cmH2O的壓力，視為吸氣末相，此條件掃描得到的CT圖像為犬吸氣末圖像；然后用丙泊酚靜脈推注安樂死的方式處死犬，取出肺組織，觀察肺大體標本變化情況。在左下肺取5 cm×5 cm×5 cm大小的肺組織稱其重量記為濕重(W)，放入80℃烤箱中烘干30 h后重新稱取重量記為干重(D)[5]，記錄濕干比重(W/D)值。在右下肺前基底段、后基底段、外基底段、右上肺尖段、右上肺前段、左上肺尖后段共6處分別取長、寬、高各為1 cm大小的肺組織，用福爾馬林固定進行石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅(HE) 染色,光鏡下觀察肺泡及肺間質改變。B組按相同的CT掃描方式進行掃描、處死及病理觀察。

結果

1.一般情況

A組(模型組)12條實驗犬中10條成模，2條失敗(實驗中途死亡)。A組所有犬均在注射油酸4～10 min開始出現呼吸頻率增快、呼吸費力、鼻翼煽動及嘴唇、顏面、粘膜紫紺；(90±10) min后動脈血氧合指數PaO2/FiO2≤200 mmHg，PAWP ≤18 mmHg，此時認定為達到ARDS狀態。B組(對照組)所有犬未見呼吸頻率增快、呼吸窘迫、口唇發紺等現象，動脈氧合指數PaO2/FiO2≥300 mmHg，PAWP ≤18 mmHg(表1)。

表1 兩組實驗前后PaO2/ FiO2及PAWP值 (mmHg)

2.肺病理表現

肺大體標本：B組(對照組)肺體積未見增大，臟層胸膜未見緊繃，肺組織表面呈淡粉色，切開未見支氣管內有肺水溢出(圖1)。A組(模型組)肺體積增大，肺重量明顯增加，臟層胸膜緊繃，肺表面可見彌漫的充血水腫，尤其是重力依賴區(背側)兩下肺呈朱紅色，類似肝組織，兩上肺散在點片狀出血點，切面疏松，切開有泡沫狀淡粉色液體從支氣管內流出(圖2)。光鏡下觀察：對照組肺組織結構完整，小葉、肺泡腔清晰，無透明膜形成，肺泡間隔無水腫、炎癥等特殊改變，肺泡間質無炎性浸潤，纖維結締組織無增生，肺泡壁無增厚(圖3)；模型組肺泡間隔明顯增寬，肺泡間隔以中性粒細胞浸潤為主，肺泡腔內有大量紅細胞、中性粒細胞、均質染色的透明膜及水腫液，肺泡大小不一，部分擴張，部分變小甚至塌陷，間質水腫明顯，組織疏松(圖4)。病理濕干比的計算方法為肺組織的濕重與同塊肺組織烘烤干后重量的比值。模型組的濕干比重(W/D)值明顯高于對照組，兩組差異有統計學意義(P<0.05，表2)。

圖1 對照組犬肺大體標本。圖2 模型組肺大體標本，兩下肺呈朱紅色，類似肝組織，有泡沫狀淡粉色液體從氣管內流出。圖3 對照組病理圖示肺組織結構完整，肺小葉、肺泡腔內清晰，無透明膜形成，肺泡間隔未見增厚，肺泡間質內未見炎性細胞浸潤(×40，HE)。圖4 模型組病理圖示肺泡間隔明顯增寬，肺泡間隔中性粒細胞浸潤，肺泡腔內有大量紅細胞、中性粒細胞、均質染色的透明膜及水腫液，肺泡大小不一致，部分閉塞塌陷(×40，HE)。圖5 模型組犬實驗前CT掃描圖像示兩肺野清晰，肺紋理走形自如，兩肺實質未見異常密度影。圖6 模型組犬ARDS成模后CT掃描圖像示近背側片狀實變影，其內可見空氣支氣管征(黑箭)，腹側肺組織可見斑片狀模糊影(白箭)。

表2 兩組犬肺組織濕干比值

注：t值=4.798，P值=0.001。

3.肺CT表現

模型組和對照組實驗前CT均表現為兩肺清晰、紋理清楚(圖5)。模型組成模后犬肺部CT圖像：近背側近重力依賴區肺部可見片狀分布均勻實變影，其內見空氣支氣管征；次近重力依賴區多呈大片狀磨玻璃密度影，分布多不均勻，其內夾雜正常肺組織；而非重力依賴區(近犬腹側)多呈小斑片狀不均勻模糊影(圖6)。

不同犬成模時的影像表現均有實變影、大片狀磨玻璃密度影、小斑片狀模糊影三種影像改變，三種影像表現的分布情況如下：①實變影均在模型犬的重量依賴區即背側肺組織，位置較固定，且都呈均勻分布；②大片狀磨玻璃密度影均在次重力依賴區，多不均勻，夾雜正常肺組織，且磨玻璃密度影與正常肺組織邊界清楚，但分布無明顯規律；③小斑片狀模糊影在犬非重力依賴區均有出現，分布多不均勻，但出現有一定規律，多位于近胸膜下肺組織。

討論

歐美協會1994年制定的ARDS診斷標準為：①有發病的高危因素；②急性起病，呼吸頻率增快和/或呼吸窘迫；③低氧血癥：ALI時動脈血氧分壓(PaO2)/吸入氧分數值(FiO2)≤300 mmHg，ARDS時PaO2/FiO2≤200 mmHg；④胸部X線檢查兩肺可見浸潤陰影；⑤肺毛細血管楔壓(PAWP)≤18 mmHg或臨床上能除外心源性肺水腫。凡符合以上5項可以診斷為ALI或ARDS[3]。ARDS的損傷因素包括直接和間接損傷，直接損傷是有害因素直接損傷肺泡上皮導致局限性的肺泡炎癥應答；而ARDS的間接損傷是有害因素通過炎癥介質穿過血液影響血管內皮導致肺損傷[6]。ALI/ARDS其病理生理基礎是大量炎癥細胞通過釋放大量炎癥介質和細胞因子而致病[7]。大量中性粒細胞、巨噬細胞的聚集和被活化，引起呼吸爆發，產生氧自由基，釋放多種炎癥介質和代謝產物造成肺泡-毛細血管膜的損傷，彌漫性肺損傷、蛋白性肺泡水腫液聚集、間質浸潤引起的小氣道狹窄及支氣管阻塞使肺泡萎陷[6]，損害使肺內炎性細胞及成纖維細胞反應性增加，造成肺血管阻塞，增加生理無效腔[8]。

筆者應用油酸進行ARDS犬模型的制作，是由于油酸是18-碳的不飽和脂肪酸，直接進入肺循環后能引起脂肪栓塞綜合征，引起急性肺損傷[9]。油酸致肺損傷作用機制包括如下幾點[10]：①氧化應激反應，油酸具有親水特性，較低濃度時即可與生物膜結合，氧化應激參與誘導肺損傷的發病；②促凝血活性增高，油酸損傷后常可發現肺泡內纖維蛋白沉積，促凝血活性明顯增高，持續較長時間的纖維蛋白沉積和積聚，可能成為導致纖維化的炎癥刺激成分之一；③內皮素作用，油酸使肺炎性細胞明顯增多，這是由于內源性內皮素通過內皮素受體依賴性機制促進循環嗜中性粒細胞向肺內浸潤，增加微血管血漿外滲。

關于ARDS模型試驗動物亦有運用兔、豬的報道[2，11]，本實驗采用犬是因為犬體型較兔大，便于觀察肺部CT圖像，更接近于人，提高了試驗結果的可參考性。豬體型較大，體重較重，不適合較少的實驗人員操作，且轉運上CT機比較麻煩。因此犬適合較少實驗人員參與的實驗，并能得到滿意的接近人類的胸部影像圖。

本組實驗中行CT掃描前運用0.1 mL維庫溴銨注入犬體內，目的是阻滯犬的自主呼吸。人在掃描前先深吸一口氣屏住呼吸，再行掃描。犬并不能像人類一樣配合進行CT掃描，為了所得胸部CT圖像清晰、便于觀察，阻滯犬的自主呼吸后，再用呼吸機給犬以35 cmH2O的壓力視為吸氣末相，可得到滿意的胸部CT影像圖。本組實驗顯示模型組成模后CT掃描均顯示肺部實變影和磨玻璃密度影，近重力依賴區肺部病變較顯著；病理表現主要為肺間隔和肺泡腔大量滲出，同時有透明膜形成，在ARDS豬模型上也有類似的CT表現[11]。

本次實驗總共運用16條比格犬，其中2條實驗中途死亡，第1條在剛注完油酸5 min后死亡，第2條在注完油酸60 min后死亡，筆者所得經驗如下：①注射油酸時應該用生理鹽水稀釋，混合均勻，盡量讓油酸變成最小油滴懸浮于生理鹽水中，油酸顆粒過大容易造成較大的肺動脈栓塞，導致犬猝死。在注射完油酸后，由于注射器管壁會有油酸殘留，應用生理鹽水多次沖洗注入犬體內，確保注射的油酸量；②保證呼吸道的通暢，注射完油酸后等待成模的后期要注意犬呼吸的變化，由于油酸造成的炎性反應，毛細血管內皮完整性破壞導致肺水腫，大量水腫液從肺泡腔內向段以上支氣管內溢出，當填滿主支氣管或氣管時，犬呼吸困難，這并不是ARDS造成的不可逆性呼吸困難，此時應該及時用吸痰機吸去氣管內的肺泡水腫液，并適量增大吸氧濃度至70%；③在等待造模過程中要密切監控犬的心率，由于炎癥反應的打擊，往往在造模過程中犬的心率容易降低至30～40次/分，此時用20 mL生理鹽水稀釋10 mL阿托品靜脈注射，如若無效增大劑量；④保證血管管道通暢，在每次采集完動脈血液時應用生理鹽水沖洗PICCO管，防止管道內血液凝固堵塞導管。

[1]Liu Q,Li W,Zeng QS,et al.Lung stress and strain during mechanical ventilation in animals with and without pulmonary acute respiratory distress syndrome[J].J Surg Res,2013,181(2) :300-307.

[2]Protti A,Cressoni M，Santini A,et al.Lung stress and strain during mechanical ventilation:any safethreshold?[J].Am J Respir Crit Care Med，2011,183(10):1354-1362.

[3]Bernard GR,Artigas A,Brigham KL,et al.The American-European consensus conference on ARDS.Definitions,mechanisms,relevant outcomes,and trial co-ordination[J].Am J Respir Crit Care Med,1994,149(3):818-824.

[4]Neumann P,Berglund JE,Andersson LG,et al.Effects of inverse ratio ventilation and positive end-expiratory pressure in oleic acid-induced lung injury[J].Am J Respir crit Care Med,2000,161(5):1537-1545.

[5]王艷玲,肖倩,吳瑛.24 h內不同俯/仰臥位通氣時間比對急性肺損傷模型病理的影響[J].中國實用護理雜志，2011,27(5)：1-4.

[6]Pelosi P,D'Onofrio D,Chiumello D,et al.Pulmonary and extrapulmonary acute respiratory distress syndrome are different[J].Eur Respir J Suppl,2003,42(22):48s-56s.

[7]譚玉軍,劉秀珍,張如意,等.JAK2/STAT1在油酸型ARDS大鼠中的作用及GCs對其調控研究[J].實用醫學雜志，2012，28(8):1259-1261.

[8]Blanch L,López-Aguila J,VillagrA,et al.Bedside evaluation of pressure-volume curves in patients with acute respiratory distress syndrome[J].Curr Opin Crit Care,2007,13(3):332-337.

[9]Schuster DP.ARDS:clinical lessons from the oleic acid model of acute lung injury[J].Am J Respir Crit Care Med,1994,149(1):245-260.

[10]陸月明.油酸致急性肺損傷動物模型析評[J].中華急診醫學雜志,2005,14(1):81.

[11]戢新平,王玉芝,楊麗麗,等.體位改變對急性肺損傷兔肺功能與CT及病理的影響[J].中華結核和呼吸雜志,2005,28(1):33-36.

Acuterespiratorydistresssyndrome(ARDS)modelindogsinducedbyoleidacidanditsCTfeatures

LI Wen,CHEN Huai,ZENG Qing-si,et al.

Department of Radiology,the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou Institute of Respiratory Disease，Guangzhou 510120,P.R.China

Objective:To investigate the way of producing acute respiratory distress syndrome (ARDS) model of dogs by oleic acid (OA) and to assess the value of CT in monitoring ARDS model of dogs.Methods16 healthy Beagle dogs were randomly divided into the model group(group A,n=12) and the control group(group B,n=4).Acute lung injury (group A)was induced by the infusion of 0.18 ml/kg OA (diluted in 30 ml of 0.9% saline) slowly through the central venous catheter in 30min and ARDS was identified while PaO2/ FiO2≤200mmHg and PCWP≤18mmHg.Group B was only infused with the same volume of 0.9% saline.Thorax CT scans were performed before and after modeling in the two groups and dogs were euthanized after CT scans. The lung tissue was removed for gross specimen and microscopic examination.At the same time, lung wet-dry weight ratio (W/D) was calculated.ResultsARDS was formed in (90±10)min after injection of OA.The lung wet to dry ratio of group A was 10.42±0.74 and there was statistical difference (P<0.05) between group A and group B.The pathological changes of ARDS included pulmonary edema, inflammatory cell exudation and hyaline membrane formation.The diffuse distribution of ground-glass opacity in two lungs was the typical CT findings of ARDS in dogs.ConclusionARDS model of dogs can be produced by oleic acid and CT can effectively monitor the formation of ARDS in dogs.

Acute respiratory distress syndrome; Dog; Oleic acid; Tomography,X-ray computed

510120 廣州，廣州醫科大學附屬第一醫院，廣州呼吸疾病研究所放射科

李雯(1987-)，女，江西人，碩士，主要從事胸部影像診斷工作。

曾慶思，E-mail:13660611505@163.com

廣東省科技計劃項目(2010B060900090)

R563.8; R814.42

A

1000-0313(2014)05-0509-04

2013-03-27

2013-09-23)