血漿let-7c在煙霧病中的表達變化及意義

趙紹云 龔 哲 張 靜 徐小隔 王天舒 焦淑杰 何 霞 滕軍放 賈延劼

鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052

血漿let-7c在煙霧病中的表達變化及意義

趙紹云 龔 哲 張 靜 徐小隔 王天舒 焦淑杰 何 霞 滕軍放 賈延劼

鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052

目的 探討煙霧病(MMD)患者血清let-7c的表達變化及意義。方法 實驗組選擇MMD患者29例，對照組選擇正常健康人群29例，腦出血15例，大面積腦梗死20例，非大面積腦梗死18例，神經免疫性疾病31例。應用實時熒光定量PCR檢測各組血清let-7c表達水平。結果 實時熒光定量PCR表明，MMD患者血清let-7c的表達水平較對照組、非大面積腦梗死、大面積腦梗死、腦出血、神經免疫性疾病患者增高，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論 煙霧病患者中血清let-7c表達上調，為其診斷提供潛在的新生物學標記物。

煙霧病；let-7c；PCR

煙霧病(Moyamoya disease，MMD)于1957年Takeuchi和Shimizui首次描述，是一種原因不明表現為床突上段頸內動脈及其Willis環的主要分支進行性嚴重狹窄直至閉塞為主要特征的特發性疾病，其發病機制尚不清楚。流行病學顯示，本病亞洲多發，6%～10%患者有一定家族史，10歲以下小兒和40歲左右成人是其兩個發病高峰。

微小RNA(miRNA)是一種大小為22 nt左右的非編碼單鏈小分子，具有高度的保守性、時序性和組織特異性，是調控基因表達的關鍵因子[1]，廣泛參與了機體的各種調節途徑。已在多種疾病中相繼發現miRNA可能作為潛在的生物標記物[2-4]，用于臨床診斷和疾病預后判斷等方面。let-7家族是最早發現的miRNA 之一，有13位成員，其中let-7c在腫瘤、炎癥等發生中有一定作用[5]，可能成為某些疾病的潛在生物標志物。本研究初步探索let-7c在煙霧病患者血清中表達變化及其意義[6]。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2013-09—2014-07就診于鄭州大學第一附屬醫院門診及住院治療患者。按照1997年修訂的Moyamoya病診斷標準，選取煙霧病患者29例為實驗組，男15例，女14例，平均年齡(45±13.74)歲；其中腦出血5例，非大面積腦梗死10例，大面積腦梗死5例，無腦梗死或腦出血9例，無感染、腫瘤、自身免疫性疾病等并發癥。對照組29例，男15例，女14例，平均年齡(45±4.81)歲；無腦血管疾病，感染、腫瘤、自身免疫性疾病等并發癥；腦出血患者15例(腦出血組)，男8例，女7例，平均年齡(48±9.90)歲；無感染、腫瘤、自身免疫性疾病。大面積腦梗死患者20例(大面積腦梗死組)，男12例，女8例，平均年齡(50±5.22)歲；非大面積腦梗死患者18例(非大面積腦梗死組)，男9例，女9例，平均年齡(48±10.70)歲；神經免疫性疾病31例(神經免疫性疾病組)，男16例，女15例，平均年齡(43±8.37)歲；其中多發性硬化10例，視神經脊髓炎5例，多發性肌炎8例，重癥肌無力8例。各組患者一般資料比較，差異無統計學意義(P<0.05)，具有可比性。所有患者均通過病史、影像學及實驗室檢查等確診。分別收集入組患者及健康正常人血液標本。該實驗由鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準，并獲得所有受試者或其委托人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 取材： 用普通生化管抽取實驗組及對照組外周靜脈血2 mL，于4℃，RCF(1 000～1 200)×g條件下離心10 min，取上層血清，分裝在已滅菌的EP管內，置于-80℃冰箱保存備用。

1.2.2 提取血清中的miRNA：按miRNA Purification Kit miRNA 提取試劑盒(康為世紀 )說明書手工提取血清miRNAs。

1.2.3 通過實時定量PCR對血清中的miRNA進行定量：按照Reverse Transcription System( Promega 公司) 說明書，將microRNA逆轉錄為cDNA,其反應的總體積為20 μL。按照GoTaq qPCR Master Mix 熒光定量檢測試劑盒說明書進行熒光定量檢測，以5 s為內參。Let-7c及內參特異性的引物序列參照miRBase database，由廣州銳博生物公司合成。每個擴增反應體系為20 μL，每例樣本重復檢測3次。應用LightCycler1.5定量PCR儀(Roche公司)進行實時定量PCR檢測。檢測miRNA的相對表達定量時，采用2-△△法進行結果分析，將各組的相對表達定量值(relative quantity，RQ)進行比較，RQ=2-△△，△△Ct=待測標本的△Ct-對照樣本△Ct，△Ct=目的基因Ct值-內參基因Ct值。

1.3 統計學方法 所有數據采用SPSS 19.0統計學軟件處理,計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis檢驗，組間兩兩比較用LSD-t檢驗或Bonferroni法，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實時定量PCR檢測結果及實驗組與對照組的血清let-7c相對表達量 各實驗組、對照組人群血漿中let-7 c及5 s的實時熒光定量PCR擴增曲線均呈“S”型；PCR產物溶解曲線均為單峰，說明擴增的目的基因特異性好且結果可靠。

表1 各組血清let-7 c表達水平

2.2 各組血清let-7c表達水平 實時定量PCR檢測實驗組、大面積腦梗死組、非大面積腦梗死組、神經免疫性疾病組、正常健康人群組的let-7 c的相對表達量，見表1。結果顯示，MMD患者血清let-7 c的表達水平較正常健康人群、大面積腦梗死、神經免疫性疾病升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；血清let-7 c在非大面積腦梗死、腦出血患者中的表達水平較MMD患者降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；但較正常健康人群升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

煙霧病(MMD)患者常以腦出血或缺血起病。成人煙霧病以腦出血為主要損害表現，多因為血管負荷加重、異常新生血管網血管壁壓力過高破裂、微小動脈瘤破裂等引起。而當顱內大血管狹窄引起血流供應減少，當代償擴張及側支循環不能滿足腦組織需要時，可發生腦梗死。

現煙霧病診斷主要依靠DSA、MRA、CTA等影像學檢查資料，尚無其他相關特異實驗室檢查指標。近年來血漿/血清中的miRNA在疾病中的作用與診斷價值引起人們的關注[7]，其性質非常穩定[8]，即使在100℃煮10 min或室溫放置數小時、-80℃和室溫下反復凍融，血漿表達水平基本不變。MMD病因不明，危險因素可能包括遺傳因素、炎癥、感染、自身免疫反應等，本研究通過檢測不同人群的血清let-7c的表達水平，可發現較腦出血、大面積腦梗死、非大面積腦梗死、神經免疫性疾病及正常健康人，MMD患者表達水平升高，提示血清let-7c可能為該疾病診斷的潛在新生物學標記物。

Let-7c嵌于長非編碼基因LINC00478，作用于許多靶基因，如TRIB2、BUB1, RAS、MYC、RTCD1、TGFBR1等[9]。C-MYC是一種多功能、核內磷酸化蛋白，參與了細胞周期進程、凋亡等過程[10]。Ras蛋白控制了參與細胞質骨架整合、細胞增殖、分化、黏附、凋亡、轉移等過程的細胞內信號轉導網絡[11]。MED28可能參與與平滑肌細胞分化調控過程,也能通過作用于表皮生長因子(EGF)影響腫瘤遷移[12-13]。RTCD1通過調控rRNA合成等參與細胞增長、細胞大小的調節。多種研究表明，let-7c通過作用于原癌基因，產生抑癌作用，已提出的作用位點有Ras/NF-κB、TRIB2[14]、Bcl-xl 、IGF1R[15-16]、ITGB3 和 MAP4K3[17]等。Let-7c能直接抑制Bcl-xl表達導致內皮細胞凋亡[18]。IGF1R、MAP4K3、Bcl-xl與mTOR信號通路相關，mTOR信號通路對血管生成、細胞遷移和血管新生與再生發揮一定作用。推測let-7c可能通過血管內皮細胞、平滑肌細胞調節與煙霧病相關的重要基因影響MMD患者血管新生與重建。有研究稱，miRNAs被運輸到微泡，并致使受體細胞基因沉默，微泡中的成膠質細胞瘤衍生的RNA可被吸收入腦微血管內皮細胞(HBMVEC)并發揮作用，let-7c也可能通過該方式調節煙霧病相關基因。

本研究表明煙霧病患者中血清let-7c表達上調，可能為該疾病診斷提供潛在的新生物學標記物。但let-7c表達水平與MMD發生發展之間是否可能有進一步的深層次關系，仍需進一步深入研究。

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(收稿2014-05-20)

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1673-5110(2014)23-0028-03