山東省西瓜細菌性果斑病的病原菌鑒定

張博等

摘要：近年來，在山東省臨沭縣、昌樂縣、章丘縣等地西瓜育苗基地的西瓜苗上發現了一種新病害——西瓜細菌性果斑病。從病果和病葉片上分離到15個細菌菌株，選取8個菌株進行致病性測定，結果表明，該8個菌株均能侵染西瓜，發病癥狀和自然發病癥狀完全一致；從接種發病的病果上可重新分離到相同的細菌。對該8個菌株菌體形態、染色反應、培養性狀及其生理生化特性等項目進行觀察測定，確認供試菌株為燕麥食酸菌西瓜亞種（Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems et al.，1992）。

關鍵詞：西瓜；細菌性果斑病；病原鑒定

中圖分類號：S432.4+2 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2014）03-0083-03

AbstractIn recent years， watermelon had been attacked by a new bacterial disease called bacterial fruit blotch （BFB） in some planting areas of Shandong Province， including Linshu， Changle and Zhangqiu. Fifteen strains were isolated from diseased fruits and leaves of watermelon. The inoculation tests were conducted with 8 strains， which produced the same symptoms as naturally infected plants. And the same strains were isolated from inoculated watermelon. Based on the mycelial morphology， staining reaction， cultural characteristics and a series of physiological and biochemical properties， the pathogens were identified as Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems et al.，1992.

Key wordsWatermelon； Bacterial fruit blotch； Pathogen identification

自2009年始，山東省臨沭縣、昌樂縣、章丘市等西瓜育苗基地西瓜普遍發生一種細菌性病害，發病程度輕重不等，如臨沭縣西瓜育苗基地所育26萬株西瓜苗全部封埋銷毀，造成極大損失。2010～2013年筆者在章丘西瓜育苗基地抽檢的西瓜苗上同樣分離到該種細菌，根據病害癥狀推測是Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems， Goor ， Thieiemans， Gillis， Kersters & Ley。因此，有必要對該細菌性病害的病原菌進行系統鑒定來加以確認，為該病害的防治提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試材料2009年從山東省臨沭縣大棚采集的雙星、京欣、極品京欣西瓜病果。對照菌株為燕麥食酸菌西瓜亞種（Acidovorax avenae subsp.

citrulli Willems et al.，1992），由山東農業大學植保學院植物病理學系提供。

1.1.2培養基NA培養基為分離培養基，KB培養基用于觀察熒光反應[3]。

1.2試驗方法

1.2.1病原菌分離、純化取病組織，用滅菌剖解刀切取病健交界處組織，75%酒精消毒2 s，移至0.1%升汞液消毒1～2 min，經滅菌水沖洗后置于小瓷皿中研磨，加無菌水浸20 min，然后用移菌環蘸取組織液在NA培養基劃線，28℃培養48 h，長出單菌落后在NA培養基再劃線，使細菌純化。純化后的各菌株編號保存冰箱中備用。

1.2.2馬鈴薯軟腐將馬鈴薯洗凈用75%酒精表面消毒，切成5 mm厚的薯片，在無菌操作下放在無菌培養皿中。將在NA培養基上培養24 h的供試菌株用移菌環接在塊莖上，28℃條件下培養48 h后，觀察馬鈴薯軟腐情況。

1.2.3病原菌的致病測定8個菌株與對照菌株在28℃條件下培養24 h，配成3×108個/ml菌懸液，噴霧和刺傷接種于健康西瓜幼苗4～6葉和果實，同時以接清水為對照（CK）。在28℃下保濕48 h，之后白天光照，晚上保濕，每天注意觀察發病情況。

1.2.4細菌學性狀細菌的格蘭氏染色、形態特征、培養性狀、生理生化測定等，主要參照《植病研究方法》[3]、《一般細菌常用鑒定方法》[7]、《常見細菌系統鑒定手冊》[2]等方法進行。

2結果與分析

2.1病害癥狀

西瓜果斑病田間可危害西瓜幼苗子葉、定植后的西瓜葉片（子葉及真葉）和果實（幼果和成熟果）。定植前幼苗發病，葉尖或葉緣出現水漬狀小斑點，逐漸向子葉基部擴展為條形或不規則形暗綠色水漬狀斑點，沿中脈變黑。真葉受害開始為水漬狀小斑點，逐漸擴大成為多角形（因受葉脈限制）或不規則形褪綠病斑，隨病情的發展，病斑逐步變為褐色，干枯下陷。西瓜果實發病后，初期在西瓜表面出現水漬狀小斑點，隨病情發展，病斑逐漸擴展為圓形或不規則形的大型暗綠色斑塊，病斑處有大量乳白色菌液溢出，后期病斑變成褐色，并多處開裂，將西瓜剖開，西瓜果肉腐爛，出現“水瓤瓜”現象，最后引起整個果實腐爛。

2.2病原菌分離

通過分離純化共獲得8個菌株用于致病性測定和病原菌的鑒定。

2.3致病性測定

8個菌株致病性測定都表現出與田間病害癥狀相同的典型癥狀。接種發病后的病斑經再分離，其菌落性狀和初分離時一致。

2.4細菌學性狀鑒定

2.4.1細菌的形態及染色反應供試8個菌株格蘭氏染色均呈陽性反應，菌體呈桿狀，兩端鈍圓，大小為（2～3）mm×（0.50～0.51）mm，不產生芽孢和莢膜，單根極生鞭毛（圖1）。

2.4.2病原菌培養性狀供試菌株在KB培養基上28～30℃下培養48 h，菌落呈乳白色，較小、圓形、隆起、有光澤、表面光滑、不透明、無黃色、不產熒光。最適生長溫度為24～30℃，41℃能生長。

2.4.3病原菌生理生化性狀測定從表1可知，8個供試菌株與對照菌株測試結果一致，都不能在KB培養基產生熒光，不產生果聚糖，（氧化）精氨酸雙水解酶陰性，不能產生吲哚，不能水解淀粉，甲基紅試驗陰性，能使馬鈴薯軟腐，氧化酶和過氧化氫酶陽性，硝酸還原產生H2S，V.P試驗陽性，明膠液化，41℃生長等。

2.4.4病原菌碳源利用從表2可知，8個供試菌株與對照菌株測試結果大都一致，8個供試菌株可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、果糖、海藻糖、棉籽糖、甘露糖、山梨醇、甜醇、肌醇等，不能利用纖維二糖、木糖、鼠李糖、β-丙氨酸、L-亮氨酸等。

3結論與討論

西瓜果斑病最早于1969年在美國佛羅里達州被發現[8]。我國報道西瓜果斑病在1998年[5]。Schaad等[9]在美國佐治亞州發現西瓜苗凋萎病，病原菌被首次鑒定為類產堿假單胞菌西瓜亞種（Psendomonas psendoalcaligenes subsp. citrulli）。 Willems[10]等根據西瓜果斑病病原菌的rRNA-DNA和DNA-DNA分子雜交研究結果，將其更改為Acidovorax avenae subsp. citrulli（Schaad et al.）。

我國吉林、福建[1，4]、海南、河北、山西等地都有類似病害發生，但多數研究大都引用國外的鑒定結果。本研究通過對山東省西瓜病果分離菌株的致病性測定，發現其發病病斑與自然發病癥狀完全一致，且從接種發病植株重新分離到完全相同的細菌。該供試菌株格蘭氏染色、菌體形態、培養性狀、生理生化測定等細菌學性狀與張榮意[5]和趙廷昌[6]的基本相同。但個別性狀如麥芽糖、棉籽糖、甘露糖、肌醇等測定結果與張榮意等的報道不同，對麥芽糖、肌醇、甜菜堿等的測定結果與趙廷昌等報道的不同。這可能由不同地區間菌系的差異或碳素化合物的純度不同造成的。

綜上所述，供試8個菌株的致病性、形態及染色反應、菌落培養性狀、生理生化性狀及碳源利用結果均一致，為同一種病原菌——類產堿假單胞菌西瓜亞種（Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli Schaad et al.，1978）[9，10]，即燕麥食酸菌西瓜亞種（Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems et al.，1992）。

我國于2006年將西瓜細菌性果斑病列入全國農業植物性有害生物。近年來，我們只對山東省個別縣市西瓜細菌性果斑病進行分離鑒定。為了防止該病的危害和擴展蔓延，減少給果農造成的損失，我們正展開對全省各縣市的全面調查并積極開展藥劑防治試驗。

參考文獻：

[1]蔡學清， 黃月英， 楊建珍，等. 福建省西瓜細菌性果斑病的病原鑒定[J]. 福建農林大學學報， 2005， 34（4）： 434-437.

[2]東秀珠， 蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京： 科學出版社， 2001：353-364.

[3]方中達. 植病研究方法[M].第3版.北京： 中國農業出版社， 1998：156-211.

[4]金言， 張俊杰， 吳燕華， 等. 西瓜細菌性果斑病的發生與病原菌鑒定[J]. 吉林農業大學學報， 2004， 26（3）：263-266.

[5]張榮意， 譚志瓊， 文衍堂， 等.西瓜細菌果斑病癥狀描述和病原菌鑒定[J]. 熱帶作物學報， 1998， 19（1）： 70-76.

[6]趙廷昌， 孫福在， 王兵萬， 等. 哈密瓜細菌性果斑病病原菌鑒定[J]. 植物病理學報， 2001， 31（4）： 357-364.

[7]中國科學院微生物研究所細菌分離組. 一般細菌常用鑒定方法[M]. 北京：中國科學院， 1978：46-49.

[8]Crall J M， Schenck N C. Bactarial fruit rat of watermelon in Florida[J]. Plant Disease Report， 1969， 53：74-75.

[9]Schaad N W， Sowell Jr. G， Goth R W， et al. Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli. subsp. nov.[J]. lnt. J. Syst. Bacteriol.， 1978， 28： 117-125.

[10]Willems A， Goor M， Thielemans S， et al. Transfer of several phyeopathogenic Pseudomonas species to Acidovorax as Acidovorax avenae subsp. avenae subsp. nov.， comb. nov.， Acidovorax avenae subsp. citrulli，Acidovorax avenae subsp. cattleyae， and Acidovorax konjaci[J]. Int. J. Syst. Bacteriol，1992，42 （1）：107-119.

2.3致病性測定

8個菌株致病性測定都表現出與田間病害癥狀相同的典型癥狀。接種發病后的病斑經再分離，其菌落性狀和初分離時一致。

2.4細菌學性狀鑒定

2.4.1細菌的形態及染色反應供試8個菌株格蘭氏染色均呈陽性反應，菌體呈桿狀，兩端鈍圓，大小為（2～3）mm×（0.50～0.51）mm，不產生芽孢和莢膜，單根極生鞭毛（圖1）。

2.4.2病原菌培養性狀供試菌株在KB培養基上28～30℃下培養48 h，菌落呈乳白色，較小、圓形、隆起、有光澤、表面光滑、不透明、無黃色、不產熒光。最適生長溫度為24～30℃，41℃能生長。

2.4.3病原菌生理生化性狀測定從表1可知，8個供試菌株與對照菌株測試結果一致，都不能在KB培養基產生熒光，不產生果聚糖，（氧化）精氨酸雙水解酶陰性，不能產生吲哚，不能水解淀粉，甲基紅試驗陰性，能使馬鈴薯軟腐，氧化酶和過氧化氫酶陽性，硝酸還原產生H2S，V.P試驗陽性，明膠液化，41℃生長等。

2.4.4病原菌碳源利用從表2可知，8個供試菌株與對照菌株測試結果大都一致，8個供試菌株可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、果糖、海藻糖、棉籽糖、甘露糖、山梨醇、甜醇、肌醇等，不能利用纖維二糖、木糖、鼠李糖、β-丙氨酸、L-亮氨酸等。

3結論與討論

西瓜果斑病最早于1969年在美國佛羅里達州被發現[8]。我國報道西瓜果斑病在1998年[5]。Schaad等[9]在美國佐治亞州發現西瓜苗凋萎病，病原菌被首次鑒定為類產堿假單胞菌西瓜亞種（Psendomonas psendoalcaligenes subsp. citrulli）。 Willems[10]等根據西瓜果斑病病原菌的rRNA-DNA和DNA-DNA分子雜交研究結果，將其更改為Acidovorax avenae subsp. citrulli（Schaad et al.）。

我國吉林、福建[1，4]、海南、河北、山西等地都有類似病害發生，但多數研究大都引用國外的鑒定結果。本研究通過對山東省西瓜病果分離菌株的致病性測定，發現其發病病斑與自然發病癥狀完全一致，且從接種發病植株重新分離到完全相同的細菌。該供試菌株格蘭氏染色、菌體形態、培養性狀、生理生化測定等細菌學性狀與張榮意[5]和趙廷昌[6]的基本相同。但個別性狀如麥芽糖、棉籽糖、甘露糖、肌醇等測定結果與張榮意等的報道不同，對麥芽糖、肌醇、甜菜堿等的測定結果與趙廷昌等報道的不同。這可能由不同地區間菌系的差異或碳素化合物的純度不同造成的。

綜上所述，供試8個菌株的致病性、形態及染色反應、菌落培養性狀、生理生化性狀及碳源利用結果均一致，為同一種病原菌——類產堿假單胞菌西瓜亞種（Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli Schaad et al.，1978）[9，10]，即燕麥食酸菌西瓜亞種（Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems et al.，1992）。

我國于2006年將西瓜細菌性果斑病列入全國農業植物性有害生物。近年來，我們只對山東省個別縣市西瓜細菌性果斑病進行分離鑒定。為了防止該病的危害和擴展蔓延，減少給果農造成的損失，我們正展開對全省各縣市的全面調查并積極開展藥劑防治試驗。

參考文獻：

[1]蔡學清， 黃月英， 楊建珍，等. 福建省西瓜細菌性果斑病的病原鑒定[J]. 福建農林大學學報， 2005， 34（4）： 434-437.

[2]東秀珠， 蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京： 科學出版社， 2001：353-364.

[3]方中達. 植病研究方法[M].第3版.北京： 中國農業出版社， 1998：156-211.

[4]金言， 張俊杰， 吳燕華， 等. 西瓜細菌性果斑病的發生與病原菌鑒定[J]. 吉林農業大學學報， 2004， 26（3）：263-266.

[5]張榮意， 譚志瓊， 文衍堂， 等.西瓜細菌果斑病癥狀描述和病原菌鑒定[J]. 熱帶作物學報， 1998， 19（1）： 70-76.

[6]趙廷昌， 孫福在， 王兵萬， 等. 哈密瓜細菌性果斑病病原菌鑒定[J]. 植物病理學報， 2001， 31（4）： 357-364.

[7]中國科學院微生物研究所細菌分離組. 一般細菌常用鑒定方法[M]. 北京：中國科學院， 1978：46-49.

[8]Crall J M， Schenck N C. Bactarial fruit rat of watermelon in Florida[J]. Plant Disease Report， 1969， 53：74-75.

[9]Schaad N W， Sowell Jr. G， Goth R W， et al. Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli. subsp. nov.[J]. lnt. J. Syst. Bacteriol.， 1978， 28： 117-125.

[10]Willems A， Goor M， Thielemans S， et al. Transfer of several phyeopathogenic Pseudomonas species to Acidovorax as Acidovorax avenae subsp. avenae subsp. nov.， comb. nov.， Acidovorax avenae subsp. citrulli，Acidovorax avenae subsp. cattleyae， and Acidovorax konjaci[J]. Int. J. Syst. Bacteriol，1992，42 （1）：107-119.

2.3致病性測定

8個菌株致病性測定都表現出與田間病害癥狀相同的典型癥狀。接種發病后的病斑經再分離，其菌落性狀和初分離時一致。

2.4細菌學性狀鑒定

2.4.1細菌的形態及染色反應供試8個菌株格蘭氏染色均呈陽性反應，菌體呈桿狀，兩端鈍圓，大小為（2～3）mm×（0.50～0.51）mm，不產生芽孢和莢膜，單根極生鞭毛（圖1）。

2.4.2病原菌培養性狀供試菌株在KB培養基上28～30℃下培養48 h，菌落呈乳白色，較小、圓形、隆起、有光澤、表面光滑、不透明、無黃色、不產熒光。最適生長溫度為24～30℃，41℃能生長。

2.4.3病原菌生理生化性狀測定從表1可知，8個供試菌株與對照菌株測試結果一致，都不能在KB培養基產生熒光，不產生果聚糖，（氧化）精氨酸雙水解酶陰性，不能產生吲哚，不能水解淀粉，甲基紅試驗陰性，能使馬鈴薯軟腐，氧化酶和過氧化氫酶陽性，硝酸還原產生H2S，V.P試驗陽性，明膠液化，41℃生長等。

2.4.4病原菌碳源利用從表2可知，8個供試菌株與對照菌株測試結果大都一致，8個供試菌株可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、果糖、海藻糖、棉籽糖、甘露糖、山梨醇、甜醇、肌醇等，不能利用纖維二糖、木糖、鼠李糖、β-丙氨酸、L-亮氨酸等。

3結論與討論

西瓜果斑病最早于1969年在美國佛羅里達州被發現[8]。我國報道西瓜果斑病在1998年[5]。Schaad等[9]在美國佐治亞州發現西瓜苗凋萎病，病原菌被首次鑒定為類產堿假單胞菌西瓜亞種（Psendomonas psendoalcaligenes subsp. citrulli）。 Willems[10]等根據西瓜果斑病病原菌的rRNA-DNA和DNA-DNA分子雜交研究結果，將其更改為Acidovorax avenae subsp. citrulli（Schaad et al.）。

我國吉林、福建[1，4]、海南、河北、山西等地都有類似病害發生，但多數研究大都引用國外的鑒定結果。本研究通過對山東省西瓜病果分離菌株的致病性測定，發現其發病病斑與自然發病癥狀完全一致，且從接種發病植株重新分離到完全相同的細菌。該供試菌株格蘭氏染色、菌體形態、培養性狀、生理生化測定等細菌學性狀與張榮意[5]和趙廷昌[6]的基本相同。但個別性狀如麥芽糖、棉籽糖、甘露糖、肌醇等測定結果與張榮意等的報道不同，對麥芽糖、肌醇、甜菜堿等的測定結果與趙廷昌等報道的不同。這可能由不同地區間菌系的差異或碳素化合物的純度不同造成的。

綜上所述，供試8個菌株的致病性、形態及染色反應、菌落培養性狀、生理生化性狀及碳源利用結果均一致，為同一種病原菌——類產堿假單胞菌西瓜亞種（Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli Schaad et al.，1978）[9，10]，即燕麥食酸菌西瓜亞種（Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems et al.，1992）。

我國于2006年將西瓜細菌性果斑病列入全國農業植物性有害生物。近年來，我們只對山東省個別縣市西瓜細菌性果斑病進行分離鑒定。為了防止該病的危害和擴展蔓延，減少給果農造成的損失，我們正展開對全省各縣市的全面調查并積極開展藥劑防治試驗。

參考文獻：

[1]蔡學清， 黃月英， 楊建珍，等. 福建省西瓜細菌性果斑病的病原鑒定[J]. 福建農林大學學報， 2005， 34（4）： 434-437.

[2]東秀珠， 蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京： 科學出版社， 2001：353-364.

[3]方中達. 植病研究方法[M].第3版.北京： 中國農業出版社， 1998：156-211.

[4]金言， 張俊杰， 吳燕華， 等. 西瓜細菌性果斑病的發生與病原菌鑒定[J]. 吉林農業大學學報， 2004， 26（3）：263-266.

[5]張榮意， 譚志瓊， 文衍堂， 等.西瓜細菌果斑病癥狀描述和病原菌鑒定[J]. 熱帶作物學報， 1998， 19（1）： 70-76.

[6]趙廷昌， 孫福在， 王兵萬， 等. 哈密瓜細菌性果斑病病原菌鑒定[J]. 植物病理學報， 2001， 31（4）： 357-364.

[7]中國科學院微生物研究所細菌分離組. 一般細菌常用鑒定方法[M]. 北京：中國科學院， 1978：46-49.

[8]Crall J M， Schenck N C. Bactarial fruit rat of watermelon in Florida[J]. Plant Disease Report， 1969， 53：74-75.

[9]Schaad N W， Sowell Jr. G， Goth R W， et al. Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli. subsp. nov.[J]. lnt. J. Syst. Bacteriol.， 1978， 28： 117-125.

[10]Willems A， Goor M， Thielemans S， et al. Transfer of several phyeopathogenic Pseudomonas species to Acidovorax as Acidovorax avenae subsp. avenae subsp. nov.， comb. nov.， Acidovorax avenae subsp. citrulli，Acidovorax avenae subsp. cattleyae， and Acidovorax konjaci[J]. Int. J. Syst. Bacteriol，1992，42 （1）：107-119.