酶法提取海狗腎多肽的工藝研究

董慧明，才 鳳，高 聳

0 引言

海狗腎(又名海狗鞭)(Testis et Penis Callorhini)是我國傳統的名貴中藥材，為海獅科動物海狗(Callorhinus ursinus Linnaeus)及海豹科動物多種海豹的雄性外生殖器[1]。早在《藥性論》就有膃肭臍的記載，海狗腎之名，出自《本草圖經》，歷代本草均有發展，到了《本草綱目》已有6種之多[2]，主要用于補腎壯陽，益精補髓，治虛損癆傷，陽痿精衰，腰膝痿弱[1]。海狗腎中富含多肽及蛋白質，是其主要的活性成分。大量研究結果表明，蛋白質攝入后，并不完全水解成氨基酸，而是大部分以肽的形式吸收，同時發現，多肽被吸收的速度比同組成的氨基酸要快[3]。大分子蛋白經酶水解后可形成大量低分子多肽，海狗腎由于其來源有限,比較珍貴，目前國內對海狗腎多肽的研究很少，本試驗對酶解法制備海狗腎多肽工藝條件進行了研究，酶解法在較溫和的條件下進行，得到的海狗腎多肽既利于人體吸收，同時又不破壞海狗腎中的天然營養成分，能夠更好地保留海狗腎肽類及氨基酸成分的生物活性，為海狗腎的深度開發利用提供有效思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 海狗腎(干品)：為海豹雄性生殖器官，包括睪丸、附睪、精囊腺前列腺及陰莖，由加拿大進口，為合法捕殺。取膨化后的海狗腎干品(海豹鞭)，去其陰莖骨，切片干燥后粉碎，備用。

1.2 主要儀器與試劑 ①儀器：U-2010紫外可見分光光度計，日本島津公司；pH計，上海虹益儀器儀表有限公司；電熱恒溫水浴鍋，河南鞏義市予華儀器有限公司；冷凍離心機，河南湘儀實驗室儀器發展有限公司；冷凍干燥機，北京松源華興科技有限公司；旋轉蒸發儀，河南鞏義市予華儀器有限公司；分析天平，德國賽多利斯儀器公司。②試劑：A.S1398精制中性蛋白酶(13萬U/g)、堿性蛋白酶(10萬U/g)，無錫酶制劑廠產，木瓜蛋白酶(80萬U/g)、胰酶(4 000U/g)，廣西南寧龐博生物科技有限公司；牛血清蛋白(BSA)，Folin-酚試劑，其他試劑均為分析純。

1.3 工藝流程 海狗腎粉末→加水→加入蛋白酶水解→煮沸滅酶→低溫靜止l2 h→離心→上清液(海狗腎多肽混合物)→脫苦脫色→濃縮→冷凍干燥→海狗腎多肽粉末。

1.4 酶解單因素實驗

1.4.1 水解酶的選擇 酶法水解動物性蛋白的報道很多，綜合文獻研究和預試驗[4-6]，采用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶，在各酶最適反應條件下進行，并測定酶解液中多肽含量，進一步選取試驗用酶。

1.4.2 酶解過程 取10 g海狗腎粉末，用選定的試驗用酶進行酶解，以酶解液中多肽含量為指標，分別對海狗腎多肽提取工藝的酶解時間、加酶量、加水量、pH值、酶解溫度5個因素進行優化。

1.5 正交方案設計 影響酶解反應的幾個主要因素為加酶量、時間、pH、溫度和加水量。根據以上單因素實驗結果，并根據原料及選定蛋白酶的性質，酶解pH確定為7.0，選定加水量(A)、加酶量(B)、酶解溫度(C)、酶解時間(D)4個因素，分別設置3個水平，進行正交試驗L9(34)[7]。采用Folin-酚法測定酶解液海狗腎多肽含量并為指標優選酶解海狗腎多肽提取最佳工藝。其因素水平表見表1。

表1 海狗腎多肽提取工藝正交試驗因素水平表

1.6 多肽含量的測定 采用Folin-酚法測定海狗腎水解液的多肽含量[8]。多肽得率(%)=多肽含量/海狗腎粉末質量×100%。

1.7 統計分析 采用SPSS 16.0統計軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 單酶的選擇 取10 g海狗腎粉末，加8倍體積的水，分別添加堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰酶各1.0%，在各酶最適pH值和溫度下酶解5 h。由圖1可見，用中性蛋白酶進行試驗的酶解液中多肽含量最高，因此選擇A.S1398精制中性蛋白酶作為試驗用酶。

2.2 不同因素對酶解反應的影響

2.2.1 加酶量對多肽含量的影響 在酶解溫度為50 ℃、加水量8倍、pH 7.0的條件下進行酶解試驗，分別加入中性蛋白酶0.2%、0.5%、1.0%、1.5%、2.5%，酶解5 h，檢測不同加酶量下的多肽含量。由圖2可知，隨著加酶量的增加多肽含量遞增，在加酶量為1.5%后曲線趨于平穩，說明在此之后增加加酶量對多肽含量無太大影響，因此正交試驗重點考察0.5%～1.5%的加酶量對多肽含量的影響。 圖2為加酶量對多肽含量的影響。

圖1 不同蛋白酶酶解多肽含量的比較

圖2 加酶量對肽含量的影響

2.2.2 加水量對多肽含量的影響 在酶解溫度為50 ℃、加酶量1.0%、pH 7.0的條件下進行酶解試驗，分別加入中性蛋白酶，在加水量為4、6、8、10、12倍下酶解5 h，檢測不同加水量下的多肽含量。由圖3可知，加水量增加時，水解度下降，其中加水量8倍時，多肽含量最高。可能是加水量增加后，酶濃度被稀釋，反而降低了多肽含量。在酶解過程中，加水量過少，反應體系過于粘稠，會導致酶解反應不充分，而加水量過多，則會增加后續處理的成本。因此正交試驗選取加水量為5、7、9倍條件下進行。

2.2.3 底物溶液pH對多肽含量的影響 在酶解溫度為50 ℃、加水量8倍、加酶量1.0%的條件下進行酶解試驗，分別加入中性蛋白酶，在pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0下酶解5 h，檢測不同pH下的多肽含量。由圖4可知，中性蛋白酶在pH 7.0的條件下酶解效果最好，酶解液中的多肽含量最高，而且反應體系本身成中性，不用過多調節pH值，故正交試驗選定在pH 7.0條件下進行。

圖3 加水量對多肽含量的影響

圖4 pH對多肽含量的影響

2.2.4 酶解溫度對多肽含量的影響 在加水量8倍、加酶量1.0%、pH 7.0的條件下進行酶解試驗，分別加入中性蛋白酶，在溫度為40、45、50、55、65 ℃下酶解5 h，檢測不同溫度下的多肽含量。由圖5可知，多肽含量隨著溫度的增加呈遞增趨勢，在50 ℃時水解度最高，再增加溫度則多肽含量開始下降。試驗表明，中性蛋白酶的最佳酶解溫度在45～55 ℃之間。

圖5 酶解溫度對多肽含量的影響

2.2.5 酶解時間對多肽含量的影響 在酶解溫度為50 ℃、加水量8倍、加酶量1.0%、pH 7.0的條件下進行酶解試驗，分別加入中性蛋白酶，考察時間為1、2、4、6、8 h下的酶解效果，檢測不同酶解時間下的多肽含量。由圖6可知，多肽含量隨著酶解時間的增加呈遞增趨勢，在酶解4 h時多肽含量曲線趨于平穩，說明在此之后延長水解時間對酶解液中多肽含量無太大影響，因此選擇3、4、5 h三個酶解時間進行正交試驗優化。

圖6 酶解時間對多肽含量的影響

2.3 正交試驗優化 試驗結果見表2。由表2可見，四個因素的極差大小順序為A>B>D>C，即加水量>加酶量>酶解時間>酶解溫度，各因素與水平的組合應為A3B3D2C2。進一步進行方差分析，結果見表3。

表2 正交試驗表及結果

表3 方差分析表

查表得F0.05(2.2)=19.00，F0.0l(2.2)=99.00，經方差分析，發現A因素極具顯著性，B因素有顯著意義，D因素接近顯著值，C因素無顯著意義，表明本試驗設計較有意義。結合R水平，得出海狗腎多肽提取最佳工藝條件：加水量為9倍量，加酶量1.5%，酶解溫度50 ℃，反應時間4 h。即最佳提取工藝為A3B3D2C2。

2.4 最佳工藝確定 精密稱取海狗腎粉末10 g，按上述最佳提取工藝A3B3D2C2提取3次，測定并計算海狗腎多肽的含量和多肽得率。結果見表4。

表4 驗證試驗表

通過正交驗證試驗可知，驗證試驗海狗腎多肽的含量均高于正交試驗結果。

3 結論

本試驗采用酶解法提取海狗腎多肽，并以海狗腎多肽含量為考察工藝的指標，通過單因素試驗研究了加酶量、溫度、加水量、pH值和時間等因素對多肽含量的影響，并采用L9(34)正交試驗表進行實驗，得出的優化組合為A3B3D2C2，從而最終確定了用A.S1398中性蛋白酶提取海狗腎多肽的工藝條件為：加水9倍量，加酶量1.5%，酶解溫度50 ℃，酶解時間4 h，pH 7.0。在此條件下提取海狗腎多肽，多肽得率可達到48.41%。

目前以海狗腎為原料的保健藥品劑型多為膠囊，如果制成膠囊服用則必須粉碎成粉末，而用常規的動物藥粉碎方法對本品來說很困難，不易成粉[9]。本試驗用酶解法提取海狗腎多肽得到多肽溶液，后冷凍干燥得到多肽粉末，該多肽粉末不僅顆粒微小，易于保存，而且除含有低分子多肽外，還含有大量的氨基酸、微量元素等活性成分，可直接開發成膠囊、軟膠囊、口含片及口服液等劑型的保健藥品，本試驗得到的酶法提取海狗腎多肽工藝可操作性強，適合規模化生產。

參考文獻：

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