大豆蛋白的酶水解及類蛋白反應對其抗氧化活性的影響

張向挺（東北農業(yè)大學理學院應用化學系 黑龍江省哈爾濱市150030）

前言：

大豆蛋白的類蛋白反映有利于催化蛋白質酶水解的逆過程，其原理就是由較低的分子質量的肽所形成一種類似與蛋白質的混合物體，在實驗的反應過程中受到水解作用、縮合作用、轉肽作用以及物理聚集作用的影響，而最終形成新結構的肽，這種轉化過程影響了其生物學的活性。化學研究者通過精心鉆研后得出結論：醋蛋白的水解物的類蛋白反應能對其抗氧化反應起到推動作用。為了驗證這項結論，本文將通過實驗的方法，深入研究大豆蛋白的酶水解以及隨后的類蛋白反應對其抗氧化活性的影響。

一、材料和方法

1.材料與試劑

在做這項實驗之前，共準備了材料：大豆分離蛋白、蛋白酶、二苯基、三硝基苯肼、連氮、鐵氰化鉀、鄰二氮菲、鄰苯三酚、其他試劑以及蒸餾水。

2.儀器與設備

為了更加準確分析實驗結果，還需要準備紫外—可見分光光度計、自動凱氏定氮儀、高速冷凍離心機、真空冷凍干燥機、全溫振蕩培養(yǎng)箱、精密pH計、分析天平、微型旋渦混合器遠紅外恒溫干燥箱、電熱恒溫水浴鍋等設備。

3.實驗方法

（1）堿性蛋白酶大豆蛋白水解物

首先需要配制出來濃度為100 mg/ml的大豆分離蛋白的液體，并通過2 mol/NaOH的溶液使之調整到pH值到8左右，并添加1000 U/g的蛋白酶，在50℃的恒溫水浴中進行酶解實驗。根據不同的水解時間分別取出20 ml的樣品，再將浴中的水迅速升溫到100℃加熱15分鐘，待到室溫冷卻后調節(jié)pH值到4.5并分離出上清液。通過這些蛋清液測試出水解度[1]。根據測試出來的結果，確定出合適的水解時間，并放大剛剛分解出的大豆蛋白水解物，冷凍干燥后備用。

（2）三硝基苯肼自由基的清除能力測試

這項實驗的具體步驟為：提取三硝基苯肼0.0079 g，用無水乙醇對其加以溶解，最后定容到100 ml，所配制出的溶液就是乙醇溶液，放到棕色瓶內并在不受陽光照射的條件下保存。同時提取1 ml的三硝基苯肼溶液和2 ml的樣品溶液加以混合，同時放置在暗處保存，讓其反應30分鐘，根據結果測定其吸光度，并通過無水乙醇來進行空白試驗。

（3）連氮清除能力測試

在此項實驗中，測定的連氮溶液要通過連氮溶液和硫酸鉀溶液的反映當中產生，此混合物要在使用前在暗處的環(huán)境下保存12-16個小時。在測評的過程中，通過連氮溶液測試吸光度，為了讓測試結果更加合理，需要連續(xù)測試三次。

（4）還原力測試

在這項實驗中，需要提取5 mg/ml的樣品溶液1 ml將其與2.5 ml的磷酸鈉溶液與2.5 ml的鐵氰化鉀溶液混合，在30分鐘的50℃恒溫中反應，反應之后迅速冷卻后加入2.5 ml的10%三氯乙酸溶液，提取2.5 ml的上清液，加入2.5 ml的蒸餾水和0.5 ml的氯化鐵溶液，均勻進行混合。在反應10分鐘后，測定吸光度，并根據實驗的結果來測定其還原力，吸光度越大表明了還原能力越強。

二、結果與分析

1.大豆蛋白水解物制備

根據實驗結果表明，大豆蛋白的水解物的抗氧化性會隨著水解度的增大而增大，水解時間越長，則水解度越高，對連氮的清除率也就越明顯。但如果水解時間延長的話，連氮清除率卻沒有顯著性的提高。

2.類蛋白反應條件的優(yōu)化

利用蛋白酶等成分對所制備的大豆蛋白的水解物進行類蛋白反應，設定一個反應的時間進行實驗，并根據實際的需要來分析出酶添加量、底物濃度和溫度對修飾產物游離氨基減少量的影響。

最后以類蛋白反應后的產物游離氨基減少量當成一個指標，利用方程式求解的方式，得到最終的類蛋白反應最優(yōu)條件[2]。

3.得出實驗結論

通過該實驗，可以看出大豆蛋白的水解物、修飾產物的抗氧化活性要遠遠高于大豆蛋白本身，類蛋白反應也能顯著提高大豆蛋白水解物的修飾產物中的抗氧化活性。因此可以得出實驗結論：大豆蛋白的蛋白酶水解、類蛋白的反應修飾，能夠應用與制備高活性的大豆蛋白抗氧化肽的研究。

三、抗氧化活性肽的作用機理

自由基是獨立存在的一種化學形式，化學性質及其活潑。自由基在通常情況下可以攻擊生命體內的大分子物質和細胞壁，造成機體本身的多種損傷，加速機體的老化。當處于正常的生理條件下，機體中的自由基可以達到一個產生與自動清除相互平衡的狀態(tài)下，但一旦機體處于不良的狀態(tài)，并隨著人類年齡的增長，機體中的自由基就會大量生產并且清楚緩慢[3]。針對這樣的現象，人們研制出一種人為的自由基清除劑，又被稱之為抗氧化劑，能夠有效清除機體當中多余的自由基，減輕其對機體的損害。

根據目前的實際情況來看，已有的抗氧化劑一般條件下會通過五種途徑來達到抗氧化的目的：抑制脂質過氧化反應、直接清除活性氧自由基、清除氧、螯合金屬離子以及激活體內本身自帶的抗氧化防御系統(tǒng)。抗氧化劑主要來源于蛋白酶的水分解物，其可以有效抑制機體內自由基的過量積累，對清除體內的自由基有著十分顯著的功效。

結論

人類許多的慢性病以及衰老的現象發(fā)生均來源于人機體內的自由基失衡，積累了過量的自由基會對人體細胞造成嚴重的損傷。為了改善這種現象，人們通過蛋白酶的抗氧化劑來幫助人們維持身體的自由基平衡。本文通過實驗研究，分析出蛋白酶水解和類蛋白反應對于其抗氧化活性的影響，并根據此實驗結果完善抗氧化劑的研制，以便于讓人類的機體更加健康，有效防止慢性疾病的產生。

[1]王鑫，江連洲，吳瑕，田瑞紅.堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白及其抗氧化活性的研究[J].東北農業(yè)大學學報，2011，（11）:24-31.

[2]宋佳天，趙新淮.大豆蛋白的酶水解及類蛋白反應對其抗氧化活性的影響[J].食品科學，2012，（01）:115-119.

[3]楊鋒，陳錦屏，陽顯瑩.醋蛋水解物的類蛋白反應及對抗氧化活性的影響[J].食品工業(yè)科技，2012，（08）:152-155.