勞氏紫瑞利共振散射熒光法測定肝素鈉

李志云，劉保生

(河北大學 化學與環境科學學院，河北 保定 071002)

肝素鈉系自豬的腸黏膜或牛肺中提取精制的一種硫酸氨基葡聚糖鈉鹽，屬黏多糖類物質. 本品具有帶強負電荷的理化特性，能干擾血凝過程的許多環節，在體內外都有抗凝血作用，主要用于防治血栓形成或栓塞性疾病(如心肌梗死、血栓性靜脈炎、肺栓塞等)及各種原因引起的彌漫性血管內凝血，也用于血液透析、體外循環、導管術、微血管手術等操作及某些血液標本或器械的抗凝處理.

測定肝素鈉的方法有光度法[1]，CdTe 量子點作探針共振瑞利散射色譜法[2]，修飾電極法[3]，高效液相色譜法[4]，電泳法[5]，電化學傳感器[6]，生物法[7]和利用稀土測試肝素鈉也有報道[8-10].本文在近中性的BR緩沖溶液中，由于勞氏紫與肝素鈉反應形成離子締合物，使得共振散射強度顯著增強，據此對肝素鈉注射液進行含量測定，方法準確、快速，對肝素鈉的快速測定有一定的意義.

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

RF-5301熒光光度計(日本島津)；pHS-3型酸度計(上海虹益儀器儀表有限公司).

肝素鈉(Heparin Sodium)對照品：準確稱取肝素鈉 0.1000 g用水定溶于100 mL容量瓶中，得質量濃度為1.0 g/L的溶液，放入冰箱中保存，用時稀釋10倍.

5.0×10-4mol/L的勞氏紫水溶液；pH =6.5的BR緩沖溶液(Britton-Robinson,H3PO4-HAc-H3BO3).實驗所用試劑皆為分析純，水為蒸餾水.

1.2 實驗方法

于10 mL比色管中，加入pH =6.5 BR緩沖溶液0.75 mL、5.0×10-4mol/L的勞氏紫溶液1.0 mL，一定量肝素鈉溶液，以水定容，搖勻，靜置15 min. 以Δλ=0(λem=λex)進行同步掃描，記錄564 nm處體系的ΔI=I-I0值(體系散射光強度I、空白溶液I0).

2 結果與討論

2.1 體系的共振譜圖

按實驗方法操作，結果見圖1. 由圖1可知，單獨的肝素鈉在測定條件下的RRS光譜較弱，勞氏紫在測定條件下無RRS信號. 在pH =6.5緩沖溶液中，勞氏紫為陽離子，肝素鈉為陰離子，兩者能通過靜電引力結合. 因此，肝素鈉與勞氏紫染料共存時，兩者反應，造成體系瑞利共振散射信號增強，產生新的瑞利共振散射光譜，其最大峰出現在564 nm.

1-4.肝素鈉的質量濃度分別為0， 0.40， 0.44， 0.47 mg/L圖1 肝素鈉與勞氏紫的共振光譜Fig.1 Resonance spectra of thionine with various concentrations of heparin sodium

2.2 酸度的影響

改變溶液酸度，按實驗方法操作，考察pH值對體系RRS的影響，見圖2. 由圖2可以看出，pH在5.0～9.0時體系的RRS較大且穩定，據此選pH =6.5作為實驗最佳酸度條件.

圖2 酸度對勞氏紫-肝素鈉體系熒光強度的影響Fig.2 Effect of acidity on fluorescence intensity of thionine-heparin sodium system

2.3 緩沖溶液用量

選用pH =6.5的BR緩沖溶液進行實驗，結果表明用量在0.5 ～ 1.2 mL時勞氏紫-肝素鈉體系的RRS最大且基本穩定，因此選0.75 mL為其最佳用量.

2.4 穩定性

按實驗方法配制溶液，對體系的穩定性進行了連續測定，每次測定間隔3 min.結果表明，體系RRS在30 min內保持不變，據此選擇靜置時間15 min.

2.5 工作曲線

改變肝素鈉溶液用量繪制工作曲線，其線性回歸方程為:ΔI=0.125+16.88ρ(mg/L)，相關系數r=0.998 4，肝素鈉的線性范圍為0.025 ～ 0.500 mg/L.測定最佳條件下11份空白溶液的RRS強度，按3 σ/K法計算得方法檢出限為9.16 μg/L，相對標準偏差是3.17%.

2.6 樣品及回收率的測定

取不同廠家或批號的肝素鈉注射液(標示量12 500單位/ 2 mL)進行含量測定，用移液管取0.1 mL于200 mL容量瓶中稀釋，再移取該溶液0.1 mL按實驗方法操作，平行6次測定其RRS強度值，以6次平均值作為測定結果并計算方法的相對標準偏差，同時加入0.2 mg/L肝素鈉標準溶液進行回收率實驗，結果見表1. 從表1可以看出，樣品平行6次測定，方法回收率為104.0%～106.4%，相對標準偏差為1.67%～3.01%，均在允許范圍內，表明結果令人滿意，方法可行. 按140單位效價/mg折算注射液的肝素鈉效價，其效價為108%～114%，符合藥典規定效價應為標示量的86%～116%標準.

表1 樣品測定結果(n =6)

參 考 文 獻:

[1] 司文會, 解鵬, 訾言勤. 夜藍褪色分光光度法測定肝素鈉[J].理化檢驗-化學分冊, 2010, 46(11): 1334-1336.

SI Wenhui, XIE Peng, ZI Yanqin. Spectrophotometric determination of heparin sodium salt by decoloration of night blue[J]. Physical Testing and Chemical Analysis(Part B:Chemical Analysis), 2010, 46(11): 1334—1336.

[2] 閆曙光, 何佑秋, 彭娟娟, 等. CdTe量子點作探針共振瑞利散射法測定肝素鈉[J].西南大學學報:自然科學版,2010, 32(3): 67-71

YAN Shuguang, HE Youqiu, PENG Juanjuan, et al. Resonance rayleigh scattering methed for determineation of heparin using CdTe QDs as the probe [J]. Journal of Southwest University:Natural Science Edition,2010, 32(3): 67-71

[3] 李曉霞, 李延清, 苗苗，等. 聚亞甲基藍碳納米管修飾電極測定肝素鈉[J]. 河南科技大學學報:自然科學版,2011, 32(2): 97-100

LI Xiaoxiaa, LI Yanqing, MIAO Miao， et al. Determination of Heparin at Polymethylene Blue-Multiwalled Carbon Nanotube Modified Electrodes[J].Journal of Henan University of Science & Technology:Natural Science,2011, 32(2): 97-100

[4] 毛平, 黃曉蘭, 李翠貞,等. 高效液相色譜法測定血漿肝素含量[J]. 中華醫學檢驗雜志, 1995, 18(6): 358-360.

MAO Ping，HUANG Xiaolan，Li Cuizhen, et al. Determination of plasma heparin by high performance liquid chromatoagraphy(HPLC) and itsclinical application[J]. Chinese Journal of Medical Laboratory Sciences,1995, 18(6): 358-360.

[5] 丁侃, 方積年. 多糖類藥物的毛細管電泳分析方法及其應用[J]. 色譜, 1999, 17(4): 346-350.

DING Kan, FANG Jinian. Capillary electrophoresis of polysaccharides and its application[J].Chinese Journal of Chromatography, 1999, 17(4): 346-350.

[6] 張莉, 李娜, 趙鳳林,等. 糖胺聚糖分析測定的研究進展[J]. 分析化學, 2005, 33(7): 1023-1028.

ZHANG Li, LI Na, ZHAO Fenglin，et al. Research progress on glycosaminoglycans analysis[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2005, 33(7): 1023-1028.

[7] 人民共和國衛生部藥典委員會. 中華人民共和國藥典第二部[M]. 北京: 化學工業出版社, 1995: 307-311.

[8] LUO Hongqun, LIU Shaopu, LIU Zhongfang, et al. Resonance rayleigh scattering spectra for studying the interaction of heparin with some basic phenothiazine dyes and their analytical applications[J]. Analytical Chimica Acta，2001, 449(1-2): 261-270.

[9] WEI Wei, WANG Hong, JIANG Chongqiu. Sepctrofluorimetric determination of trace heparin using lomefloxacin-terbium probe[J]. Spectrochimica Acta Part A，2006, 63(2): 241-246.

[10] LI Jing, LIU Jinkai, ZHU Xiaojing, et al. Spectrofluorimetric determination of heparin using doxycycline-europium probe[J]. Journal of Luminescence，2005, 113(3-4): 305-313.