Toll 樣受體9與自身免疫性糖尿病

鄭金玨 陳夢蝶 綜述 鄭超 審校

1 Toll樣受體概況

Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)屬1型跨膜蛋白，是哺乳動物主要的天然模式識別受體, 參與病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)的識別，引發信號轉導，啟動多種與炎癥反應相關的基因轉錄，導致炎癥介質的釋放，并最終激活獲得性免疫系統。Toll樣受體在不同種生物體內保持高度的同源性，目前已證實在哺乳動物體內存在的TLRs有TLR1-TLR13共13種[2，11]。目前已經有7種TLR被鑒定出其相應配體[3,12]，如TLR1，2，6可以協作識別細菌細胞壁的肽聚糖（PGN）和細菌脂蛋白（BLP），TLR3可以特異性識別病毒分子中的dsRNA，革蘭氏陰性菌細胞壁成分脂多糖（LPS）是TLR4的激動劑，TLR5識別細菌鞭毛蛋白，TLR7和TLR8可以特異性識別ssRNA[4]，TLR9主要參與并激活由病原體CpG基序刺激后細胞信號通路,引起大量炎性因子的產生[5,7]。

2 TLR9的生物學特性

2.1 TLR9的結構與分布

人類TLR9基因位于第3號染色體（3p2113）,有2個外顯子組成，全長約5kb。TLR9基因與MyD88基因相連，以單外顯(monoexonic)或者雙外顯(biexonic)等兩種最常見的拼接方式表達[8,12]。TLR9蛋白由1032個氨基酸編碼，其分子結構與TLR家族其他成員一樣，都是由胞膜外區、跨膜區、胞漿區組成。小鼠的胞外區LRR有16個，而人有18個[9]。TLR9蛋白在脾臟中表達量最高，其次是卵巢、外周血白細胞，胸腺、肺、腸、前列腺、腦和胰腺。在各種免疫細胞中TLR9的表達量也有很大差異，尤其是記憶性B淋巴細胞和胞漿樣樹突狀細胞(DC)表達最為豐富[10]。

2.2 TLR9的配體

研究證實，TLR9的天然激動劑是CpG。CpG是存在于細菌或病毒基因組中出現頻率較高的非甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸(cytosine phosphate—guanosine，CpG)序列，這些短核苷酸序列具有免疫活性。將含有CpG基序的細菌或病毒DNA稱CpG DNA，人工合成的含有CpG基序的寡核苷酸(oligodeexynucleotide，ODN)序列稱CpG ODN。Melinda A[11,14]等通過體外實驗發現，用CpG寡核苷酸序列刺激TLR9+的乳腺癌細胞MDA-MB-231和T47-D，可以降低血清基質金屬蛋白酶抑制因子-3（TIMP-3）的表達，而在TLR9-的乳腺癌細胞MCF-7中無此現象。Labzhinov PA等[3]研究發現，敲除了TLR2，TLR4基因的小鼠，對CpG DNA仍具有反應性，比如脾臟淋巴細胞的增殖，巨噬細胞分泌炎癥細胞因子以及樹突狀細胞的成熟加快等。而敲除TLR9基因的小鼠(TLR9-/-)則無以上反應。這些研究結果都說明TLR9通路的激活與CpG DNA有緊密聯系。

2.3 TLR9對CpG DNA/ODN的攝取

無論是來自細菌或者病毒的CpG DNA還是人工合成的CpG DNA都可通過細胞的非序列依賴性胞吞作用攝入細胞體內，形成內體。Vollmer J等[14]發現，包含CpG DNA/ODN的內體在P13激酶、Rab5以及GTP結合蛋白的調控下，不斷成熟，酸化，進而激活TLR9介導的信號途徑。但是CpG骨架的結構影響細胞對其攝取，有實驗證實CpG ODN經過硫代磷酸化修飾后更容易被細胞攝取，而且增強了原有序列的免疫刺激活性，而甲基化修飾卻無此作用[13]。

2.4 TLR9-MyD88信號轉導機制

CpG-ODN與細胞表面接觸后，通過胞吞作用進入細胞內形成內體形式，隨著內體的成熟、酸化，TLR9被招募并識別CpG-ODN，兩者結合形成二聚體[14，15]。髓樣細胞分化因子88（MyD88）包含兩個結構域，TIR結構域位于C末端，N末端有個“死亡”結構域，與白介素-1受體相關激酶（IRAK）的死亡結構域高度同源，在受刺激后可被招募。因此結合了CpG-ODN的TLR9招募MyD88分子與之結合，形成MyD88-TLR復合物。該復合物與白介素-1相關蛋白激酶（IRAK）4結合并激活IRAK 4后，反過來作用于IRAK 1，使之高度磷酸化。IRAK 1高度磷酸化后從之前的復合物上解離下來，與轉接蛋白TNF受體相關因子6（TRAF6）相互作用形成復合體[15,16]。TRAF6介導的途徑有好多條，其中一條通過激活轉化生長因子β（TGFβ）激活激酶1(TGF-activated kinase 1,TAK1)，活化的TAK1順序激活IKK,IKK的激活使IκB磷酸化從NF-κB上脫落并被泛素化，使得NF-κB由抑制狀態被激活從而引發NF-κB轉位入核并激發一系列后續免疫反應。另一條轉導途徑是P38介導的MAPK途徑。這是一條經典炎性反應途徑，又稱為NAPK應急信號通路。Yiqun Zhang等[15]也曾報道過，活化的TRAF6可通過結合轉接轉蛋ECSIT，作用于MAP-3的激酶MEKK-1，經過P38進一步刺激絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），進而激活c—Jun／Fos，最終引起免疫應答。

3 TLR9介導的信號通路與自身免疫性糖尿病發病

近來的一些重要研究提示：TLR9信號通路不僅在感染誘導的炎癥損傷中起到作用，而且在自身免疫性糖尿病的發病中也起到重要作用。Wong等[17]將NOD小鼠的TLR3和TLR9兩個基因分別敲除，結果在TLR3缺如和雜合型NOD小鼠中，發病率無顯著性差異。然而TLR9缺如小鼠則較TLR9雜合子的NOD小鼠表現出明顯的保護作用。Zhang等[15]最近觀察到：單獨或聯合使用CpG寡脫氧核苷酸或CD40(共刺激分子)能激活致糖尿病性T細胞和誘發8.3-TCR轉基因鼠糖尿病的發病。而TLR9抑制肽段則阻滯了8.3-TCR轉基因鼠糖尿病的發病，氯喹（TLR受體阻滯劑）延緩了NOD鼠的糖尿病的發病，同時觀察到胰腺旁淋巴結中的DC的激活減少。

TLR9介導的免疫信號通路，幾乎是NF-κB依賴性的，NF-κB在炎癥介質的產生和抗體釋放中起到至關重要的作用。CpG-DNA刺激TLR9-MyD88信號通路，導致IRAK和TRAF6的磷酸化，最終通過激活NF-κB起作用[14.15,16]。

4 小結與展望

綜上所述，CpGDNA/ODN激活TLR9后,哺乳動物細胞內的天然免疫應答和適應性免疫應答均被激活，調節炎癥細胞因子的分泌，誘導機體產生以Th1型占優勢的免疫應答。但是，對于CpGODN/TLR9介導的細胞轉導通路的機制還有一些疑問，如與病毒感染密切相關的自身免疫性內糖尿病是如何通過TLR9介導的信號轉導改變細胞因子及共刺激分子表達、影響APCs功能，從而引起T細胞過度活化，產生針對自身抗原的T細胞，打破免疫耐受等具體機制還有待進一步研究。相信隨著對TLR9信號通路研究的不斷深入，自身免疫性糖尿病的發病機制將會得到進一步的闡明，必然會提高對該類糖尿病的預防和治療水平。

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