貓傳染性鼻-結膜炎疫苗研究進展

趙艷麗，董宏偉，2，陳小慶，劉秋艷，胡桂學

（1.吉林農業大學動物科技學院，吉林 長春130118；2.吉林省農業廣播電視學校，吉林 長春130021）

貓杯狀病毒（feline calicivirus，FCV）能引起貓的多發性口腔和呼吸道傳染病，還可引起結膜炎，故又稱為貓傳染性鼻-結膜炎病毒。FCV 是杯狀病毒科皰疹病毒屬（Vesivirus）的成員之一，其基因組為單股正鏈RNA，無囊膜，核衣殼呈二十面體對稱。

目前FCV 感染已呈世界性分布。幾乎所有的貓科動物均易感，一歲以下的貓最易感，也有感染狗的報道。FCV 感染貓通常僅局限于口腔和上呼吸道，有些毒株還可以引發機體產生慢性胃腸炎和急性關節炎癥狀。FCV 在貓群中高度流行，主要是因為許多臨床康復的貓仍然是病毒攜帶者。該病雖發病率較高，但死亡率較低。然而病毒變異產生的強毒株可以引起嚴重的急性致死全身性疾病（virulent systemic disease，VSD）及出血熱樣疾病的暴發，致使貓死亡率增加。

目前貓傳染性鼻-結膜炎尚沒有特效的治療方法，疫苗免疫接種是防制該病的主要措施。傳統疫苗在病毒防制過程中起到重要的作用，但是這些疫苗只能減少臨床發病率和病毒的排出，可能無法防止感染。隨著分子生物學、基因工程技術的發展，新型疫苗的研究也不斷被嘗試。本文對國內外有關該病疫苗的研究進展綜述如下。

1 傳統疫苗

1.1 滅活疫苗 該類疫苗優點是安全性好，能夠減少由FCV 引起的臨床癥狀，缺點是不能誘導有效的黏膜免疫和細胞免疫應答，因而無法有效抑制呼吸道中FCV 的復制。此外，接種部位有時會形成纖維肉瘤，以氫氧化鋁佐劑疫苗較為嚴重。

De man marc 等首次報道注射貓細小病毒（feline panleukopenia virus，FPLV）、皰疹病毒（feline herpesvirus，FHV）和FCV 滅活疫苗后在貓雙側胸部產生纖維肉瘤的案例[1]。Jas 等將由改性的FPLV、FHV，滅活的FCV 制備成的非佐劑重組疫苗RCPCh-FeLV 接種8～9周SPF貓，結果顯示，接種疫苗一周后，經FHV和FCV 攻毒，免疫貓的臨床表現顯著低于對照組，FPV、FHV和FCV排出量顯著減少，證實接種疫苗的第7 天開始產生免疫應答[2]。

由于中和性表位大部分位于衣殼蛋白高變區，用單價FCV 疫苗不能完全預防FCV 感染。因此，為提高交叉中和反應，多價疫苗成為FCV 疫苗新的研究方向。Poulet 研究證實了不同毒株具有交叉保護作用，隨后以具有交叉保護作用的FCV 株（FCV431 和FCVG1）制成了非佐劑滅活二價疫苗（PUREVAX RCPCh-FeLV），疫苗對異源株產生的免疫保護作用與體外交叉中和反應有關，同時也說明交叉中和試驗可以用于選擇FCV 疫苗株，同樣適用于引起VSD 的高致病毒株[3]。Masubuchi 等研發了一種三價滅活疫苗Kyoto Biken Feline-CPR，其中包含的3 個FCV 株的免疫和基因特性差異較大，經攻毒試驗顯示，該疫苗更有潛力應對蔓延整個日本的FCV 的抗原多樣性[4]。

1.2 減毒活疫苗 該類疫苗能較好地刺激機體產生保護性免疫，但存在毒力返祖問題。有證據表明，活疫苗病毒在某些情況可能引起臨床癥狀，甚至引起流行感染。

Radford 等將疫苗失敗獲得的分離株的序列歸為兩類：大多數疫苗失敗獲得的分離株與疫苗株序列存在21.33%～38.00% 的差異，而在某些情況下僅產生0%～5.33% 的變異，說明分離株可能來源于疫苗。此外，與來自同一個疾病暴發的分離株密切相關，僅產生0%～1.33% 的變異，而與流行病學無關的分離株存在20.67%～38.00%的差異[5]。Hohdatsu 等認為商業的FCV 疫苗A、B、C和D 產生的免疫血清相對能較好地中和FCV 試驗株：F4，F9，FCV-255。而對野毒株的中和效果不理想。說明疫苗株和日本流行的FCV 株之間中和抗原差異顯著，需要改進FCV 疫苗[6]。Porter研究表明，兩個FCV 疫苗株（FCV-F9 和FCV-255）仍然存在廣泛的交叉反應，F9 抗血清中和87.5%，FCV-255 抗 血 清 中 和75%[7]。Kanellos 等 將 貓 抗FHV、FCV 和FPLV 的凍干三價改性減毒活疫苗溶解在液體重組的亞單位貓白血病病毒（feline leukemia virus，FeLV）（p45 包膜蛋白）中，結果顯示，混合兩個疫苗對安全和效果都沒有產生不利的影響[8]。Huang 研究發現，雙株FCV 疫苗（FCV 和VS-FCV）比單一毒株疫苗能刺激產生更廣泛的交叉中和抗體，并且能夠使免疫貓當面臨一個伴隨致死性系統疾病的同源FCV 株感染時臨床癥狀減輕[9]。Lappin 將SPF 貓接種滅活或減毒活FVRCP（2 個改性的活的FVR、FCV、FeLV）疫苗后，兩個FVRCP 疫苗對FCV 血清反應率間沒有數據上的差別[10]。

還有學者對該類疫苗接種部位、接種時間及非特異保護作用進行研究。Lappin 等將SPF 貓接種FVRCP 疫苗，鼻內接種與注射接種FVRCP 疫苗的貓比較，FCV 攻毒后，更有可能在1 d 和14 d 對血清轉化（疫苗產生抗體）[11]。Wilson 等研究發現，同時在貓不同部位注射佐劑疫苗FeLV 和貓多價疫苗或單次注射二者的混合疫苗后，能對FeLV，FCV，FHV，FPV強毒攻擊產生相同的保護效果。兩種注射方式在臨床評分或低水平持續抗原血癥上與對照組相比差異顯著[12]。Schultz 等研究發現，在16 周或以上接種單劑量的改性活病毒貓核心疫苗（抗FPLV，FCV和FHV）可以提供高比例動物的長期免疫力，同時也能增加群體免疫[13]。Bradley 等研究發現，鼻內接種減毒活FHV-1 疫苗和FCV 疫苗的貓能減少由實驗室感染的支氣管敗血波氏桿菌引起的臨床癥狀，這個非特異性免疫有利于抵抗疫苗不可用的感染并在疫苗引起體液免疫之前起到保護作用[14]。

2 新型疫苗

2.1 亞單位疫苗 此類疫苗以生物化學和物理方法從病毒培養物中提取、純化有特異性的抗原而制成。FCV 的結構蛋白主要由VP1、VP2 組成，其中衣殼蛋白VP1 是誘導機體產生免疫反應的主要結構蛋白，由于它只含有病原體的一部分，不會導致動物發病。

Komolafe 等報道了FCV 亞單位疫苗，該疫苗來自于與整個FCV 抗原相似的亞單位組成。當致命毒株攻毒時疫苗對貓有保護作用，而對照組則出現了FCV 引起的典型臨床和病理癥狀[15]。

2.2 活病毒載體疫苗 此類疫苗是將外源基因插入到某些病毒載體基因組內，使之高效表達但不影響該疫苗株的正常生存與繁殖。

Yokoyama 等將編碼FCV-F4 株衣殼蛋白整個開放閱讀框的基因插入到FHV-1 的胸苷激酶缺陷突變株（c7301dltk）的缺失位點（SmaI site）。重組病毒設計成C7301dlTK-Cap。通過眼內、鼻腔和口腔途徑接種貓開展體內試驗，免疫貓在很大程度上能抵抗親本FCV F4 株和FHV1 C7301 株的致命感染。隨后又構造了進一步改進的重組FHV-1（dlTK（gCp）-Cap），它在C7301dlTK-Cap FCV 前體衣殼蛋白基因上游帶有一個假定的FHV-1 gC 啟動子序列。通過試驗證實dlTK（gCp）-Cap 的FCV免疫原性抗原高表達，經致死性的FCV 攻毒，顯示含有dlTK（gCp）-Cap的疫苗比含有C7301dITK-Cap 的疫苗更有效[16]。Mccabe 等在構建了表達FCVF9 株衣殼基因的減毒重組黏液瘤病毒之后，將FCV F9、LS015 的衣殼蛋白基因分別插入到黏液瘤生長因子（MGF）位點、絲氨酸蛋白酶抑制劑（SERP 2）基因位點，生產了一個表達FCVF9 和LS015 衣殼蛋白基因的二價黏液瘤重組體。免疫貓能夠對F9 株和LS015 株產生高水平的血清中和抗體。目前還沒有證據證明黏液瘤-FCV重組病毒從免疫的貓到未免疫的貓之間傳播，這種嵌合疫苗可能對廣泛的FCV 株產生有效的保護作用[17]。

2.3 核酸疫苗 此類疫苗是把外源基因克隆到真核質粒表達載體上，然后將重組質粒DNA 直接注射到動物體內，通過外源基因在體內表達產生的抗原激活機體的免疫系統，進而引發免疫反應。DNA 疫苗不包含活病毒或人工佐劑，具有潛在的廣泛用途。

Sommerville 等將貓接種包含FCV-F9 株成熟衣殼蛋白的質粒（pF9VAC），利用異源FCV LS027株進行攻毒試驗，雖然全部貓都出現臨床癥狀，但是疫苗組的直腸溫度和一般的臨床癥狀評分都顯著低于對照組，并且在潰瘍分布上也存在顯著的差異。雖然兩組在感染初期都沒有檢測到血清學反應，但是在感染后期疫苗組滴度普遍高于對照組。結果顯示，DNA 疫苗對FCV 感染起到部分保護作用[18]。

2.4 病毒樣顆粒疫苗 FCV 成熟的衣殼蛋白能夠自我組裝成空衣殼即病毒樣粒子（VLPs），形態和抗原與天然毒株相似，包含一個分子量約為60 kDa 的衣殼蛋白，它不具有感染性。新的基于VLPs 免疫原性的免疫策略能夠提供改進抗FCV感染的安全性。

Martino 等發現，利用桿狀病毒表達系統生成的FCV 衣殼蛋白產生的VLPs 能夠與FCV 抗血清反應。VLPs 免疫家兔，能引起對臨床樣本中分離到的一些FCV 株的中和抗體。說明利用桿狀病毒表達系統生成的FCV 衣殼蛋白可能作為一個安全有效的抗FCV 的重組疫苗，該重組疫苗有助于描述VLPs 在抗原不同FCV 感染的效果，FCVVLP 被看作是抗FCV 感染的候選疫苗[19]。

3 結語

由于FCV 的變異和相關致死性疾病的發生，現在的疫苗很多都失去了效力，免疫失敗的案例時有發生，迫切地需要制備新型有效的疫苗。隨著反向遺傳操作技術的發展，應用RNA 病毒反向遺傳系統可以重現病毒的生活周期和感染模式，對闡明病毒的起源、致病機制和免疫交叉保護提供一種切實可行的方法。我們課題組正致力于利用反向遺傳操作技術，制備一種新型疫苗，進而減少由FCV 引起的致死性疾病的發生。

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