豬嵴病毒的特征及檢測技術研究進展

莊金秋，梅建國，姚春陽，王 艷，李 峰，沈志強

(山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600)

豬 嵴 病 毒（Porcine kobuvirus，PKV）屬于小RNA病毒科（Picornaviridae）嵴病毒屬（Kobuvirus） 成員[1]，是一種新發現的無囊膜的單股正鏈RNA病毒，可引起仔豬的病毒性腹瀉。自2010年底以來，我國大部分省份規模化豬場相繼發生了以乳豬高發病率、高死亡率、藥物防治效果差、現有疫苗免疫效果多不明顯為特征的豬病毒性腹瀉疫情[2]。其主要癥狀為哺乳仔豬多在出生2～3 d后先嘔吐，后腹瀉，體質量下降及嚴重脫水，迅速死亡，母豬和育肥豬無明顯癥狀[3]。據報道，在這次疫情中檢測到病毒主要包括豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diamhea virus，PEDV）、 豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis of swine virus，TGEV）、豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，PRoV）、沙波病毒（Sapovirus）、豬博卡病毒（Porcine Boca virus，PBoV）和PKV。雖然研究發現PEDV在此次腹瀉疫情中占主要地位，但應用豬流行性腹瀉和傳染性胃腸炎二聯疫苗等常規腹瀉疫苗強化免疫效果并不明顯，而且乳豬腹瀉循環反復發生。此次腹瀉疫情持續時間長，不僅造成了仔豬成活率降低，感染2周內仔豬發病率高達100%，死亡率在80%以上，5日齡內的仔豬死亡率更是達到100%，而且造成飼料轉化率降低、日增重低等后果，給養豬業造成了極大的危害和嚴重的經濟損失[4]。PKV是否與當前的疫情有關，尚無定論。但由于PKV陽性檢出率相對較高，專家分析可能與其他腸道病毒如PEDV、TGEV和PRoV發生混合感染或成為疾病發生的誘導因素，甚至有可能對動物乃至人類健康造成潛在的威脅[5]。因此，及時加強對PKV的研究具有重要的現實意義。本文對PKV的由來和發現、病毒的分類地位、基因組結構、蛋白質、流行病學及檢測方法等研究現狀做一簡要概述，為科研人員對PKV的研究及了解仔豬病毒性腹瀉疫情的整體概況提供參考。

1 病毒的由來和發現

2007年匈牙利科學家Reuter等[6]根據用于擴增杯狀病毒RNA依賴的RNA聚合酶基因所設計的通用引物，在利用RT-PCR方法檢測10日齡以下仔豬腹瀉糞便樣品中否存在豬杯狀病毒屬（Porcine calicivirus）的諾如病毒（Norovirus）和沙波病毒時擴增出一條非特異性條帶，序列分析發現與愛知病毒有一定的同源性，系統發育分析顯示屬于嵴病毒屬成員，這是首次在豬糞便中檢測到PKV，我國也于同期分離到了該病毒，這2株分離毒株分別被命名S-1-HUN 和 swine/2007/CHN[7]， 而且這2株毒株也被認可為PKV的參考毒株，從此揭開了PKV研究的序幕。此后，PKV在匈牙利、泰國、日本、韓國、巴西和荷蘭等國家相繼被報道，陽性檢出率很高，并且發現在具有腹瀉癥狀的豬群中，陽性率明顯高于無腹瀉癥狀的豬群[8]。目前關于PKV的研究相對較少，PKV與人和動物各種疾病的關系還有待進一步研究。

2 病毒的分類地位

根據國際病毒分類委員會（ICTV）2013年2月份最新的病毒分類報告，目前小RNA病毒科已包含17個屬，嵴病毒屬包含的3種病毒分別進行了重新命名，即人愛知病毒（Aichi virus，AiV）正式更名為愛知病毒A（Aichivirus A），牛嵴病毒（Bovine kobuvirus，BKV）更名為愛知病毒B（Aichivirus B），作為原來的一個候選種，PKV被正式確定為一個新種，被命名為愛知病毒C（Aichivirus C）[9]。目前為止，嵴病毒屬已經公認的只有這3個種。

3 病毒的流行病學特點

PKV目前在世界范圍內廣泛流行，在腹瀉和健康乳豬群、斷乳仔豬群、肥育豬群、母豬群的糞便或血清樣品中陽性檢出率均很高，在具有腹瀉癥狀的乳豬群中尤甚，而且在這些發病乳豬中其他常見腹瀉病毒如TGEV、PEDV和PRoV的檢出率并不高。盡管如此，PKV是否與豬的腸道疾病相關，目前尚無定論。病毒通過何種途徑傳播，目前也沒有確切的證據證明。有專家認為病毒可能從胃腸道系統轉入了血液循環系統，從而導致病毒血癥，糞-口途徑也可能是PKV的傳播途徑之一。另外，也可能存在其他傳播途徑，如哺乳、血液及食物等[10]。

4 病毒檢測技術研究進展

4.1 病毒的分離培養

嵴病毒屬人AiV能在BS-C-1和Vero細胞上增殖并產生明顯的細胞病變，但不能引起人體細胞如人宮頸癌細胞（HeLa細胞）、人胚肺細胞（HEL細胞）、人惡性胚胎橫 肌瘤細胞（RD細胞）及乳鼠細胞病變[11]。BKV能在Hela細胞上增殖并且引起病變[12]。而PKV目前尚未找到合適的培養細胞，體外培養尚未成功[13]。

4.2 血清學檢測技術

日本學者用抗AiV單克隆抗體建立的ELISA檢測方法，用于檢測糞便中AiV，結果表明此方法比病毒分離更敏感，比病毒中和試驗更簡便快捷，但迄今并沒有商業化的試劑盒[14]。Yamashita 等通過電鏡和SDS-PAGE等方法獲得了純化的BKV病毒粒子蛋白并制備抗血清，建立了一種可檢測BKV的ELISA檢測方法。國內學者陳蕾等[15]（2012）對PKV的主要結構蛋白即中和抗體結合蛋白VP1蛋白進行了表達，并對其主要的抗原表位、二級及三級結構進行分析。該結果為PKV特異性抗原的免疫印跡和ELISA等血清學方法的建立提供了科學的參考依據，有助于進一步推進PKV的研究。

4.3 分子生物學檢測技術

4.3.1 PCR技術

目 前，Reuter等[16]（2009） 根 據豬嵴病毒屬3種嵴病毒AiV、BKV和PKV的最保守區域（3D區域）設計引物，能成功地檢測到上述3種病毒，這為嵴病毒分子流行病學的調查及宿主物種的檢測提供了可能。Khamrin等[13]（2010）于2009年從日本28個豬場的健康豬群采集了293頭份糞便樣品進行RT-PCR檢測，結果檢出PKV陽性率為45.4%（133/293）。我國自2009年首次檢測到PKV以來，目前多個省市自治區均有檢測到該病毒的報到。胡軍勇等[17]（2012）根據PKV的3D基因建立RTPCR方法，并用此法對在湖北省各大豬場采集的165頭份病料進行檢測，結果檢測出陽性樣品118份，在具有腹瀉癥狀的豬群中PKV的陽性率高達82.5%，而在非腹瀉豬群中PKV的陽性率只有13.23%，并且研究還發現PKV在仔豬中的陽性率要高于育肥豬和種豬中的陽性率。王長松等（2012）于2010年從位于上海市閔行區、青浦區和奉賢區的3個規模豬場采集了116頭份豬糞便樣品，經RT-PCR檢測，共檢出PKV陽性樣本15份，陽性率為38.8%，3個規模豬場的陽性率分別為46.7%、35.1%和32.4%，說明上海豬群中PKV感染率較高。張莎等（2013）于2012年利用RT-PCR方法對我國24個省市84個豬場的236頭份病料樣品進行PKV檢測。結果共檢出PKV陽性樣本63份，陽性率為36.69%；而在檢測的84個豬場中，共有36個豬場顯示PKV陽性，豬場陽性率為42.85%，除了我國西北地區未檢測到PKV之外，其他地區均檢測到了PKV，并且該病毒在華中和華東地區流行最為嚴重。張文波等[18]（2013）根據PKV的3D基因設計引物建立RTPCR檢測方法，其最小檢測量可達2.3 pg。對江西省2010年冬至2012年2月收集的100份仔豬PEDV陽性樣品進行PKV檢測，陽性率達42.86%。李淞等[19]（2013）根據PKV的3D基因設計引物建立的RT-PCR方法，最低可以檢出1 pg的病毒核酸，而且該方法在病毒含量較低的情況下，也能準確檢測出病毒核酸，具有較高的敏感性，能夠有效地對早期感染豬群進行診斷和監控。高敏感性和特異性引物的設計成功，為嵴病毒分子流行病學調查提供了可靠的技術支持，敏感性也大大高于ELISA。

4.3.2 實時熒光定量PCR技術

實時熒光定量PCR同普通PCR相比，具有更高的敏感性，能高效、準確、快速地檢測出PKV。修金生等（2012）根據PKV的3D蛋白序列基因設計引物，建立了檢測PKV的SYBR Green I實時熒光定量RT-PCR方法。該方法可實時定量分析病毒核酸在動物體內的含量來明確其PKV感染水平和確定感染靶器官，同時為PKV的早期診斷提供重要參考。劉孟良等（2013）也建立了檢測PKV的SYBR Green I實時熒光定量RT-PCR方法，其最低檢出拷貝數為100拷貝，且具有良好的穩定性和較高的精確度。

5 展望

PKV是一種新發現的病毒，它不僅具有傳染性而且在世界范圍內廣泛分布，給世界豬業帶來危害的同時也給科研人員帶來了挑戰和機遇。目前關于PKV的研究才剛剛起步，其細胞感染機制、流行病學特征、病毒感染的病理生理學及免疫學等方面的研究較少，相關報道也比較匱乏。盡管普遍認為PKV可能感染豬的胃腸道，但在發生或沒有腹瀉病癥的豬糞便或血清樣品中均能檢測到PKV。這說明PKV可能是條件性常在病毒，感染率高并不能確定其是否與仔豬腹瀉相關，仍需要病毒分離與動物回歸試驗證實其與仔豬腹瀉的關系，也可能是因為PKV與其他腸道病毒的混合感染成為疾病發生的誘因。因此，對嵴病毒的結構和功能、發病機制、傳播機制、致病性、臨床表現、免疫應答和基因遺傳演化等方面的深入研究將成為未來嵴病毒研究的重點，只有這樣才能有助于對PKV的真正認識和有效防控。相信隨著分子生物學和免疫學技術的不斷發展，人們對嵴病毒的認識會越來越深刻，將會得到更多仔豬病毒性腹瀉的相關知識，對于規模性豬場防控仔豬腹瀉提供更全面及時的信息和更多有用的方法和技術。

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