犬椎間盤脫出模型的建立及其脊髓微循環與組織學變化觀察

王雪喬，饒宇騰，吳偉澎，程 鵬，李 偉，姜代勛，陳 武

(1.北京農學院(中醫藥)北京市重點實驗室；2.北京農學院動物科學技術學院，北京 102206)

椎間盤脫出癥是人類醫學和獸醫臨床上犬的多發病和疑難病。通過外科手術減壓療法解除脊髓壓迫，是常用治療方法之一，但在犬對深部痛覺喪失超過48 h的重癥病例無效。然而以電針為主的針灸療法，在無創的情況下對犬的椎間盤脫出癥顯示療效同樣顯著[1]，其機理可能與改善脊髓微循環和組織微觀結構有關，需要進一步研究。由于對臨床病例的脊髓狀態評價困難，且已有的犬椎間盤脫出模型多為短時間(0.5～1) h壓迫[2-4]，不能很好地模擬和評價重癥椎間盤脫出癥的過程。本研究嘗試建立犬的椎間盤長時間脫出模型，并采用激光散斑多普勒血流測定法(Laser-Doppler flowmetry, LDF)監測壓迫后脊髓血流量(spinal cord blood flow, SCBF )和組織學變化，為進一步揭示犬椎間盤脫出癥的病理與治療機理積累資料。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年雜種犬9只，體重(5～10) kg (7.97±1.03)，動物生產合格證號[SCXK(京)2011-0006]，飼養于北京農學院實驗動物房[SYXK(京)2010-0003]。實驗犬隨機分為正常對照組(n=3)，模型組(n=6)。正常對照組不進行手術，常規飼喂。

1.2 主要儀器和試劑耗材

激光多普勒散斑血流檢測視頻系統(PeriCam PSI System, Perimed, Sweden)，呼吸麻醉機(SurgiVet,美國)，超聲骨刀(速邁醫療)，高頻電刀(北京中科科儀技術發展有限責任公司)，碘海醇(50 mL：15 g，揚子江藥業集團有限公司)，異氟烷(100 mL，魯南貝特制藥有限公司)，注射用氨芐西林(悅康藥業集團北京凱悅制藥有限公司)，6Fr一次性無菌雙腔導尿管(大連庫利艾特醫療制品有限公司)，焦油紫(Sigma-Aldrich)，蘇木精(Amresco Company)，伊紅(Amresco Company)。

1.3 犬椎間盤脫出模型的建立

麻醉前15 min阿托品(0.02 mg/kg)皮下給藥，靜脈推注丙泊酚(6 mg/Kg)誘導麻醉，氣管插管異氟烷吸入維持麻醉。

動物俯臥保定，以第一腰椎(L1)為中心消毒。手術嚴格無菌操作，第13胸椎至第2腰椎(T13-L2)棘突左側旁開約1.5 cm切開皮膚，沿皮膚切口切開皮下脂肪，顯露并切開淺深層外筋膜，鈍性分離髂腰肋肌纖維，骨膜剝離器鈍性剝離背最長肌、多裂肌，切斷附著肌腱，牽引器緊貼肋頭前緣放置在創口前后，高頻電刀切斷乳頭突周圍附著肌肉，用咬骨鉗去除乳頭突，超聲骨刀打磨L1-L2段錐板，錐板咬骨鉗暴露左腹側L1-L2段脊髓。將6Fr雙腔導尿管沿硬膜向前伸至T12-T13，向內緩慢注入約0.5 mL碘海醇(圖1)，封堵固定導尿管，脊髓血流監測完畢后分層縫合切口。術后肌注抗生素(氨芐西林，25 mg/kg，每天3次)，第2天正常飼喂，對食欲不振者行常規輸液支持療法。

術后進行X線檢查，確認氣囊壓迫存在(圖2)，并進行運動機能評分，判斷造模是否成功。

壓迫48 h后氣囊減壓，抽出導管解除壓迫。

圖1 球囊壓迫法，沿硬膜插入后注入碘海醇。

圖2 犬椎間盤脫出模型壓迫后X線片。

1.4 SCBF微循環測定

術中暴露L1-L2段脊髓后，LDF散斑血流檢測儀監測血流5 min，導尿管壓迫后監測血流5 min，14 d后再次開創暴露脊髓，監測相同脊髓段血流10 min。(儀器相關參數設定: 監測激光與L1-L2段脊髓垂直，探頭與L1-L2段脊髓左側的監測距離設定約為16 cm，分辨率為0.15mm，監測區域圖像面積約10～15 mm2，圓心位于L1段脊髓左側的中心，采樣頻率: 10圖像/s)

1.5 運動功能評分

同一執業臨床獸醫師于術前、1 d、4 d、7 d、14 d采用犬TSCIS評分法[6-7]，從步態、本體感受器定位、痛覺感受方面對各組犬的運動功能進行評價(正常為10分)。 步態：最小離地間隙是指在犬肢體伸展時將四肢抬離地面的能力；本體感受器定位：本體感受的測定方法：給予外力支撐犬的體重，輕輕地將其爪背面著地，恢復正常位置的時間超過2 s則判為反應遲鈍。傷害感受：深部傷害感受的測定方法：止血鉗橫行鉗閉遠端肢體或者甲床。淺部傷害感受的測定方法：止血鉗鉗夾趾間蹼。

1.6 脊髓組織病理學觀察

14 d后采集損傷段脊髓，HE和焦油紫染色觀察脊髓組織學變化并進行神經元計數。觀察脊髓白質和灰質神經元形態及神經元數量變化，脊髓中央管水平線以下設為計數面積，神經元采用人工雙盲計數法[8]，P<0.05表示組間差異顯著，P<0.01表示組間差異極顯著。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 犬椎間盤脫出模型的運動功能評分結果

圖3 犬壓迫前后運動功能評分結果(P<0.01)

圖3可見，術前TSCIS評分結果皆為滿分10分。術后第1天左、右后肢的評分結果分別為(0.33±0.23)、(0.67±0.37)，兩后肢均喪失深部痛覺。與壓迫前相比，后肢運動機能評分下降極顯著(P<0.01)，至術后14 d左后肢(3±0.37)、右后肢(4±0.71)運動機能評分有所升高，但與術前相比仍舊極顯著下降(P<0.01)，模型建立成功。正常對照組1 d及14 d左右后肢運動功能評分均為滿分10分。

2.2 犬椎間盤脫出模型脊髓血流量變化

圖4 犬椎間盤脫出模型壓迫前后脊髓血流量變化(P<0.05)

犬椎間盤脫出模型壓迫后5 min(94.08±12.52)和14 d后(97.36±10.39)脊髓血流量顯著低于(P<0.05)壓迫前(131.02±5.67)(圖4)。

2.3 犬椎間盤脫出模型脊髓組織形態學觀察

正常對照組脊髓白質纖維束排列緊密有序，左側腹角灰質可見深藍色大而圓的神經元且數量較多，多突起，胞漿內尼氏小體結構完整，細胞核位于中央；模型組脊髓白質纖維束斷裂，成空泡狀，灰質可見神經細胞崩裂，尼氏小體不明顯，神經元數量減少，出現固縮。脊髓腹角(脊髓中央管水平線以下)正常神經元計數模型組為(13.58±3.14)個，極顯著低于(P<0.01)正常對照組(34.52±4.68)個(圖5,6見彩插1)。

3 討論

椎間盤脫出癥是由于椎間盤的纖維環變性破裂，中央髓核脫出壓迫脊髓及其相應脊神經根，導致神經通路被阻斷，同時壓迫造成脊髓血液循環障礙，加速神經細胞死亡，引起運動機能障礙[9]。臨床實踐中，動物短時間內出現的重度癱瘓往往伴隨后肢深部痛覺完全喪失甚至尿閉或尿失禁，這多由于髓核瞬時壓迫引起脊髓急性損傷，隨著壓迫持續存在進而引起脊髓局部缺血缺氧造成繼發性損傷[9]。球囊壓迫法能夠較好地模擬椎間盤脫出引起的急性重度持續性壓迫，并可對壓迫程度進行適度的調節，且重復性良好。早期球囊壓迫法是通過椎板全切術暴露脊髓進行壓迫，但對脊髓周圍組織的損傷較大。經過改良，現多采用經皮穿刺至蛛網膜下腔后壓迫[10-13]，但此法也有其局限性，主要是壓迫位置很難準確定位在脊髓正下方或側下方，因而無法模擬椎間盤髓核脫出對脊髓的壓迫。此外，由于沒有暴露脊髓，所以無法直接監測脊髓微循環血流量的變化。本研究采用的半椎板切除術是解除髓核壓迫的臨床常用手術通路，其既減少對脊髓周圍組織的損傷又客觀評價脊髓狀態，更接近犬椎間盤脫出癥的自然損傷過程，符合理想椎間盤脫出模型的要求。球囊內注入碘海醇代替生理鹽水，有利于術中定位及術后評價。研究結果模型組后肢運動機能極顯著下降，出現后肢癱瘓，失去深部痛覺，與臨床上犬的椎間盤脫出癥一致。

微循環障礙是機體原發性和繼發性致病的重要因素，也與細胞再生和機能恢復密切相關，因此對其進行測定能客觀評價脊髓損傷和機能恢復的程度。激光散斑血流監測儀是一種監測組織血流的常用方法，其通過光電探測器接受反射光，然后轉化成電信號，生成組織血細胞移動的數據。Yasminda Malik等[14]指出LDF受多種因素影響，例如室溫、體位、外部光源等因素。為此，本實驗在監測過程中保持室溫在25℃，關閉無影燈，加熱毯溫度保持在38℃，輸液暫停，同時人員保持安靜，減少走動，盡最大可能減少干擾因素，以獲取可信的數據。

課題組前期研究表明椎間盤脫出大鼠模型SCBF下降顯著，且壓迫后即刻下降，前后分界明顯[5]。本試驗觀察到椎間盤脫出模型犬SCBF同樣下降顯著，但壓迫后瞬時脊髓血流量呈緩慢下降至穩定值，這可能與壓迫物選擇不同和種屬間差異有關。壓迫后脊髓血流量顯著下降，且14 d后脊髓血流量仍保持較低水平，這說明急性和慢性的脊髓血流微循環障礙可能是椎間盤脫出癥致病的重要機制。

造模后14 d在觀察到脊髓微循環血流量顯著降低的同時，模型組出現神經元變性壞死、尼氏小體固縮、白質空泡化等形態學變化。已有研究表明脊髓灰質神經元的遷移受血管密度和分布影響[15]，說明脊髓微循環障礙對神經元修復的影響。提示調節脊髓微循環，改善脊髓神經細胞微環境，促進脊髓神經細胞再生和重構可能是治療該病的關鍵。14 d后脊髓造影顯示壓迫部位造影劑仍無法正常通過，說明壓迫并未隨著解壓而消失，這可能正是發病48 h后手術減壓效果不佳的原因。

上述結果表明，此球囊壓迫法建立的重度椎間盤脫出模型能夠再現臨床經過，可以作用于觀察脊髓微循環和組織形態學變化，用于該病病理和治療機理的相關研究。

參考文獻：

[1] 陳武，吳英偉，郭澤領，等.犬椎間盤病的中西結合診療與病例分析[C]. 中國畜牧獸醫學會論文集，中國，中國畜牧獸醫學會，2003，128-131.

[2] Lee JH,Choi CB,Chung DJ,et al. Development of an improved canine model of percutaneous spinal cord compression injury by balloon catheter[J]. J Neurosci Methods , 2008,167 :310-316.

[3] Lim JH,Jung CS,Byeon YE,et al. Establishment of a canine spinal cord injury model induced by epidural balloon compression[J]. J Vet Sci,2007,8:89-94.

[4] 于向華, 劉鄭生. 壓力球囊置入法致頸脊髓慢性壓迫實驗模型的建立[D]. 中國人民解放軍軍醫進修學院，碩士學位論文，2003.

[5] 盧知松，陳益山，姜代勛，等. 椎間盤脫出大鼠模型的脊髓血流量變化及電針效應[J]. 中國實驗動物學報，2011，19(5)：381-386.

[6] Gwendolyn JL,Jonathan M. L,Christine M. B,et al.Description and repeatability of a newly developed spinal cord injury scale for dogs[J].Prev Vet Med,2009,89:121-127.

[7] Byung OK,Ying L,Yiwen R,et al.Neuropathologies in transgenic mice expressing human immunodeficiency virus type 1 tat protein under the regulation of the astrocyte-specific glial fibrillary acidic protein promoter and doxycycline[J]. Am J Pathol, 2003,162:1693-1707.

[8] 虞攀峰，王巖. 新型犬脊髓損傷模型的建立和激光多普勒眷髓血流評價[D].中國人民解放軍總醫院，軍醫進修學院，博士學位論文，2011.

[9] Lahunta AD,Glass EN. Veterinary Neuroanatomy and Clinical Neurology(Third Edition) [M]. American Elsevier, 2009. 243-280.

[10] Fukuda S,Nakamura T,Kishigami Y,et al.New canine spinal cord injury model free from laminectomy [J]. Brain Res Protoc, 2005,14:171-180.

[11] 盧鵬. 實驗動物脊髓的損傷模型[J]. 中國骨與關節損傷雜志，2008，23(2)：174-176.

[12] 白殿卿，沈寧江. 犬脊髓損傷治療動物模型[J].中國實驗動物學報，2002，10(2)：120-122.

[13] Purdy PD, Duong RT, White CL, et al. Percutaneous translumbar spinal cord compression injury in a dog model that uses angioplasty balloons: MR imaging and histopathologic findings[J]. Am J Neuroradiol,2003,24:177-184.

[14] Yasminda M,David S,Martin K,et al.Laser-Doppler M easurements of spinal cord blood flow changes during hemilaminectomy in chondrodystrophic dogs with disk extrusion[J]. Vet Surg,2009,38:457-462.

[15] 王志新，王卉，王延芬，等.小鼠脊髓灰質發育過程中細胞遷移與血管之間的關系[J].神經解剖學雜志，2013，29(4)：415-420.