開放翼腭動脈改良制備大鼠自體血栓腦梗死模型比較

周 震，王雪巖，王 坤，王 凱，張玉蓮

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

腦梗死又稱缺血性卒中，本病系由各種原因所致的局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性病變壞死，進而產(chǎn)生臨床上對應(yīng)的神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)，在整個卒中中占很大比例[1]。腦梗死依據(jù)發(fā)病機制的不同分為腦血栓形成、腦栓塞和腔隙性腦梗死等主要類型。其中腦血栓形成是腦梗死最常見的類型，約占全部腦梗死的60%[2]，因而通常所說的“腦梗死”實際上指的是腦血栓形成，迅速溶栓，恢復(fù)血流是最基本、最有效的方法[3]。隨著我國人民生活水平的不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)、生活方式和疾病譜逐漸發(fā)生變化，青年腦梗死患病率有逐年上升的趨勢[4]，給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。為探索血栓性疾病的原因、病理生理變化,開展新療法,預(yù)測臨床轉(zhuǎn)歸，動物模型的建立是不可缺少的手段，近年來，國內(nèi)外學(xué)者通過不同方法建立了多種MCAO模型[5]，本文在Busch[6]，張新江等[7]的實驗方法的基礎(chǔ)上對模型做了進一步改良，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選擇健康SD大鼠33只，為保耐受度與均衡度，全部選用雄鼠，體重200 g左右，SPF級，來源于北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2009-0004】，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所飼養(yǎng)【SYXK(津)2011-0008】，分為三組，其中對照組3只、普通手術(shù)組15只，改良手術(shù)組15只。實驗中對動物的操作符合《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1.2 實驗材料

麻藥(10%水合氯醛)，2, 3, 5 -氯化三苯基四氮唑( triphenyl tetrazolium chloride, TTC，Sigma)毛細(xì)玻璃管(0.5 mm)，凝血酶，刀片(普通吉列剃須刀片)，手術(shù)器材(手術(shù)剪一個，彎頭鑷子兩個，縫合針，縫合線)，5.5號靜脈輸液針，動脈夾，載玻片，離心管，碘伏，慶大霉素。

1.3 栓子制備

取健康大鼠一只進行內(nèi)眥取血0.5 mL，立即注入含有0.75 μL檸檬酸鈉(0.109 mol/L)的EP管內(nèi)，混勻后5000 r/min離心1 min。取貧血小板血漿160 μL，RBC 10 μL與1單位凝血酶(25萬單位/L)、30 μL氯化鈣(0.5 mol/L)溶液混合，立即將其吸入毛細(xì)玻璃管中。為確保血凝的質(zhì)量，取完血的毛細(xì)玻璃管平放，靜置2 min。2 min后，用生理鹽水浸潤后將毛細(xì)玻璃管從中間掰斷，并在保持血栓不被拉斷的情況下輕輕至于載玻片上，載玻片上的所有操作要確保在生理鹽水的浸潤下進行。輕輕將所有的血栓全部拉出，最后用刀片將血栓切成1～1.5 mm大小的栓子，放在盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中備用。

1.4 模型制備

注：CCA=頸總動脈，ICA=頸內(nèi)動脈，MCA=大腦中動脈，PCA=大腦后動脈，ECA=頸外動脈，PPA=翼腭動脈，ACA=大腦前動脈。

改良手術(shù)組：采用10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔麻醉后，頸正中切開皮膚，剝離肩胛舌骨肌、胸骨舌骨肌與胸骨乳突肌，暴露頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery,ICA)與頸外動脈(ECA)。分離左側(cè)ECA與ICA[3-4]。游離ECA遠(yuǎn)端并結(jié)扎之，凝閉其分支，并再次在ECA下穿過縫合線，備用。用金屬動脈夾暫時夾閉CCA，用5.5號靜脈輸液針逆行穿刺左側(cè)ECA至CCA，稍過ICA起始處，然后用穿過備用的縫合線扎緊，隨即用1 mL注射器緩慢推注栓子鹽水懸液直至所用栓子全部進入CCA，撤出輸液針的同時扎緊進針孔。撤去動脈夾后恢復(fù)ICA的血供，使栓子通過ICA，在動脈血恢復(fù)的瞬間沖擊下進入顱內(nèi)至大腦中動脈，縫合皮膚。肌注慶大霉素(0.5 mL/只)以抗感染。假手術(shù)組手術(shù)方法同模型制作，只在注射時以等量生理鹽水代替栓子溶液(見圖1)。

普通手術(shù)組：在注入栓子之前結(jié)扎翼腭動脈，其余方法同改良手術(shù)組。

1.5 模型評價

1.5.1 動物蘇醒后按Bederson評分[9]：無神經(jīng)損傷癥狀為0分；懸尾實驗不能完全伸展對側(cè)前爪為1分；前肢抵抗對側(cè)推力能力下降為2分；向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為3分。

表1 Bederson評分

表2 梗死灶體積

1.5.2 手術(shù)24 h后斷頭取材，完整剝離大鼠全腦，﹣80℃冰凍5 min，至于腦槽上切片后行TTC染色，計算梗死區(qū)體積。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 Bederson 評分

與對照組比較，兩個手術(shù)組評分均明顯升高，說明兩個手術(shù)組均出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷，兩個手術(shù)組之間比較，沒有表現(xiàn)出明顯差異(P> 0.05)。

2.2 梗死灶的體積

手術(shù)24 h后TTC染色見普通手術(shù)組與改良手術(shù)組均出現(xiàn)白色壞死區(qū)域，并且兩組梗死體積相差不大(P> 0.05)，對照組無白色梗死區(qū)出現(xiàn)(圖2)。

3 討論

3.1 關(guān)于PPA的結(jié)扎問題

在以往的實驗研究中實驗者傾向于將同側(cè)翼腭動脈(PPA)同時結(jié)扎[10]，但是PPA的位置特別深，大約在ICA與ECA分叉上1～1.5 cm處，實驗操作中不容易分離及操作，同時也因為它是ICA的分支，并且直徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于ICA，所以本實驗通過控制栓子的大小而不需要結(jié)扎來避免栓子通過PPA。通過實際試驗操作及結(jié)果來看，不接扎PPA并不影響實驗結(jié)果。

3.2 關(guān)于不同體重大鼠的選擇問題

大鼠的重量是影響本實驗的一個關(guān)鍵因素。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，體重過大的大鼠ECA及CCA過于粗壯，栓子不容易造成梗塞，體重過小又不利于針頭穿刺進入CCA進行栓子注入，所以選擇大鼠時控制體重在200 g左右。

3.3 關(guān)于栓子的制備問題

栓子的大小要嚴(yán)格控制在1～1.5 mm之間，因為太小的栓子不能確保大于PPA的直徑，從而有從PPA通過的可能，太大的栓子不容易從5.5號靜脈輸液針頭通過，容易堵塞針頭而影響注射。其次，將栓子吸入5 mL注射器時應(yīng)先將針頭拔下再吸入，不可用針頭直接吸入，這樣避免了吸入率低及容易產(chǎn)生氣泡等問題。栓子吸入以后先將輸液針管內(nèi)注滿生理鹽水然后靠栓子重力緩慢滑至針頭尾端，并且保證每個栓子之間有一定距離從而使它們依次被注入血管。

3.4 關(guān)于ECA結(jié)扎問題

遠(yuǎn)端結(jié)扎線盡量靠上，留出足夠的空間進行針尖穿刺；近端結(jié)扎線盡量靠近分叉口，可以防止栓子流回ECA。

3.5 關(guān)于實驗結(jié)果問題

通過最后對大鼠形態(tài)的評分比較及TTC染色可以明顯體現(xiàn)兩個手術(shù)組與對照組的區(qū)別(P< 0.05)，表明實驗結(jié)果有意義；并且兩個手術(shù)組之間沒有明顯差別(P< 0.05)

3.6 關(guān)于本實驗的優(yōu)缺點問題

本實驗沿用張新江等[11]的栓子制備方法，可造成MCAO的同時而不發(fā)生自溶，并且易被溶栓劑溶解。同時由于控制了栓子大小的前提下，開放PPA不接扎，并且在注入栓子的操作中，用普通輸液針頭代替留置針，采用雙線分段結(jié)扎，動脈夾單獨夾閉CCA的方法，使得實驗更簡便易行，節(jié)省操作時間，降低手術(shù)死亡率。

參考文獻(xiàn)：

[1] Yu HL, Zhang ZL, Chen J,etal. Carvacrol, a food-additive, provides neuroprotection focal cerebral ischemia/reperfusion injury in mice [J]. PLoS One, 2012, 7(3): 33584.

[2] 王文化,趙冬,吳桂賢,等. 北京市1984-1999年急性腦出血和腦血栓發(fā)病率變化趨勢分析[J]. 中華流行病學(xué)雜志, 2002,23 (5):352-355.

[3] 王左生,連亞軍,趙莘瑜,等.腦梗死患者溶栓治療前后經(jīng)顱多普勒檢測及其臨床意〔J〕.中國危重病急救醫(yī)學(xué),2002,11:699.

[4] 杜娟,蔡藝靈,崔永強,等. 青年腦梗死的病因及預(yù)后分析[J]. 中國腦血管病雜志,2009,12:626-630.

[5] 陳俊拋,田時雨,于微微,等.多發(fā)性腦梗塞癡呆模型的研究.中華神經(jīng)精神科雜志,1994,27(6):311.

[6] Busch E, Kruger K, Hossmann KA. Improved model of thrombolic stroke and r-tPA induced reperfusion in the rat. Brain Res, 1997,778(1):16.

[7] 張新江,常麗英,張?zhí)K明,等. 大鼠自體血栓大腦中動脈閉塞模型的改良[J]. 卒中與神經(jīng)疾病,2003,(01):12-15.

[8] The Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China. Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals. 2006-09-30.

[9] Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M,etal. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 1986;17(3):472-476.

[10] 李建生,劉敬霞,于海濱,等. 大鼠自體血栓結(jié)合線栓阻塞大腦中動脈制備腦缺血模型的建立與評價[J]. 中國危重病急救醫(yī)學(xué),2006,(05):272-274.

[11] Vanderschuern S, Vlaenderen IV, Collen D,etal. Intravenousthrombolysis with recombinant staphylokinase versus tissue-typeplasmanogen activation in a rabbit embolic stroke model. Stroke,1997, 28(7):1383.