長(zhǎng)爪沙鼠不同willis血管類型全基因組文庫(kù)構(gòu)建

張 賀，陳振文，王承利，孫 倩，陸 娜，王 洋

(1. 沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科，沈陽(yáng) 110015；2. 首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，北京 100669)

腦卒中，又稱腦血管意外(cerebrovascular accident，CVA)，俗稱“中風(fēng)”，是由向大腦供血的動(dòng)脈血管缺血引起的一種急性疾病[1]。腦卒中給人類健康和生命造成極大威脅，給患者帶來(lái)極大痛苦，家庭及社會(huì)負(fù)擔(dān)沉重[2]。因此，為提高預(yù)防與治療水平，研究腦卒中的發(fā)病機(jī)制，找到合適的腦動(dòng)脈缺血?jiǎng)游锬Ｐ统蔀楫?dāng)務(wù)之急[3]。

長(zhǎng)爪沙鼠(Merionesunguiculatus，Mongolian Gerbil)是一種具有獨(dú)特生物學(xué)特性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源[5-6]，其腦底動(dòng)脈環(huán)(Willis circle)前后交通支血管缺失的遺傳特征，成為研究人類腦缺血的天然動(dòng)物模型[7-8]，通過(guò)簡(jiǎn)單的結(jié)扎方法即可獲得比大鼠、小鼠更加典型的人類腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ蚚9-11]。為了進(jìn)一步研究不同Willis環(huán)與基因表達(dá)差異的關(guān)系，建立包含全部Willis血管類型的全基因組文庫(kù)，為后續(xù)研究打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年長(zhǎng)爪沙鼠96只，雌雄各半，體重50～70 g之間，清潔級(jí)，由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供【SCXK(京)2010-0020】。實(shí)驗(yàn)在沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院進(jìn)行【SYXK(軍)2012-002】,并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材及主要試劑

手術(shù)器械，多功能實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解剖臺(tái) 萊爾(北京)凈化設(shè)備有限公司； Library Production Kit和pCC1FOS Vector 均由EPICENTRE Biotechnologies公司提供；基因組DNA小量制備試劑盒由AxyPrep公司提供。

1.3 Copy Control Fosmid文庫(kù)的構(gòu)建

1.3.1 基因組DNA的提取

安樂(lè)死術(shù)處死動(dòng)物后，快速剪下頭部，剪去顱骨，小心剝離腦組織，用生理鹽水洗去血污，置于解剖臺(tái)下觀察腦底動(dòng)脈環(huán)前交通支(anterior communication arteries, ACA)和后交通支(posterior communication arteries, PCoA)的類型，剝離腦組織與血管，用苯酚氯仿法[12]從不同willis血管類型的組織中提取DNA，混合后將其溶解在TE溶液中，濃度為0.5 μg/ μL。

1.3.2 基因組DNA的剪切

取DNA溶液，至少包含2.5 μgDNA。用200 μL槍頭反復(fù)吹吸DNA 100次，使基因組DNA充分剪切。

1.3.3 基因組 DNA的末端修復(fù)

反應(yīng)體系：無(wú)菌水，2 μL；10×Buffer，8 μL；dNTP Mix，8 μL；ATP，8 μL；DNA，50 μL；End-repair enzyme Mix，4 μL；一共80 μL。

室溫下放置培養(yǎng)45 min，然后加入TE緩沖液，70℃培養(yǎng)10 min，使End-repair enzyme Mix失活。通過(guò)末端修復(fù)，可以得到平末端、5’-磷酸化的DNA。

1.3.4 連接反應(yīng)

反應(yīng)體系：無(wú)菌水，1 μL；Fast-Link 10×ligation Buffer，1 μL；PCC2Fos Cloning-ready Vector，1 μL；ATP，1 μL；DNA，5 μL；Fast-Link DNA Ligase，1 μL；一共10 μL

室溫培養(yǎng)2 h，然后將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移到70℃培養(yǎng)10 min，使Fast-Link DNA Ligase失活。

1.3.5 Copy Control Fosmid 克隆的包裝

在包裝反應(yīng)前，將過(guò)夜培養(yǎng)的宿主菌EPI300-TIR Plating Strain接種到含有10 mmol/L MgSO4的50 mL的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)。10 μL連接反應(yīng)加入25 μL已經(jīng)融化的packaging Extracts中；用移液器混勻，30℃包裝90 min，加入剩余的25 μL packaging Extracts至管中，30℃下包裝90 min。

1.3.6 Copy Control Fosmid文庫(kù)的涂布和篩選

按照每100 μLEPI300-TIR宿主菌溶液中加入10 μL稀釋后噬菌體微粒的比例將兩者混合；37℃噬菌體吸附20 min；將感染了噬菌體的細(xì)菌涂布到含有12.5 mg/mL的LB平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑選Copy Control Fosmid克隆。

1.4 基因組DNA文庫(kù)的鑒定

1.4.1 總克隆數(shù)CFU的鑒定：

取包裝產(chǎn)物10 uL感染細(xì)菌(EPI300-TIR)100 μL后，涂布LB平板(含氯霉素)，第二天計(jì)數(shù)。

總克隆數(shù)CFU=平板上的克隆數(shù)/0.01 mL×N mL

1.4.2 平均插入片段及重組率的鑒定：

隨機(jī)挑取15個(gè)克隆分別接LB液體培養(yǎng)基(含氯霉素)，搖菌后抽質(zhì)粒，并與陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒(約36 kb)同時(shí)跑電泳后(1%Agarose; 1.3V/cm；約12～16 h)，鑒定插入片段大小和重組率。

2 結(jié)果

2.1 不同willis血管類型

通過(guò)解剖，發(fā)現(xiàn)不同類型的willis環(huán)缺失(圖1和圖2)。

注：A：左前交通支；B：右前交通支；C：后交通支。

如圖所示，根據(jù)willis環(huán)不同程度、不同位置的缺失，共可分為前交完整，后交完整(TO4組)，前交右缺，后交完整(NO2組)，前交右缺,后交缺失(NP1組)，前交左缺，后交缺失(TO3組)，前交完整，后交缺失(CJ1組)，前交左缺，后交完整(NK組)。

2.2 基因組DNA鑒定

以36 k標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為對(duì)照組，對(duì)剪切后各組樣品基因組DNA進(jìn)行鑒定(圖3)。

2.3 總克隆數(shù)CFU的鑒定

注：A：左前交通支；B：右前交通支；C：后交通支。1：TO4組 前交完整，后交完整；2：NO2組 前交右缺，后交完整；3：NP1組 前交右缺，后交缺失；4：TO3組 前交左缺，后交缺失；5：CJ1組 前交完整，后交缺失；6：NK組 前交左缺，后交完整。

庫(kù)容鑒定瓶皿上平均克隆數(shù)為17個(gè)，平板上的CFU/ml=17/0.01 mL。總克隆CFU=平板上的CFU/mL× mL=1700×1=1700(圖4)。

注：1：36K對(duì)照；2：NO2組；3：CJ1組；4：NK組；5：TO4組；6：TO3組。

圖4 總克隆數(shù)CFU的鑒定圖

2.4 鑒定平均插入片段及重組率

以36K標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為對(duì)照，進(jìn)行電泳。平均插入片段>30 kb，約36 kb左右。隨機(jī)挑選15個(gè)克隆株，其中14個(gè)含有重組片段，重組率約93%(圖5)。

3 討論

3.1 長(zhǎng)爪沙鼠willis circle的特點(diǎn)

長(zhǎng)爪沙鼠是我國(guó)特有的一種小型草原動(dòng)物，易于獲得，大小適宜，具有獨(dú)特的腦血管遺傳特征，是一種很好的人類腦缺血疾病模型動(dòng)物。[1, 13-14]與大小鼠等嚙齒類動(dòng)物腦底動(dòng)脈分布不同，長(zhǎng)爪沙鼠小腦上動(dòng)脈與大腦后動(dòng)脈之間缺少明顯的后交通動(dòng)脈，不能構(gòu)成完整的Willis環(huán)，并有1/3以上缺失前交通動(dòng)脈或前交通動(dòng)脈一個(gè)組成根很細(xì)，利用此解剖學(xué)特征，結(jié)扎動(dòng)物的一側(cè)頸動(dòng)脈，可導(dǎo)致該側(cè)大腦半球缺血，從而獲得典型的人類腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ停湟罁?jù)即為聯(lián)系大腦兩個(gè)半球的腦底動(dòng)脈前交通支和溝通基底動(dòng)脈和大腦后動(dòng)脈的后交通支均存在著不同程度的缺失，結(jié)扎單側(cè)或雙側(cè)頸總動(dòng)脈均能造成不同程度的腦缺血，而不像用其他動(dòng)物制備該模型時(shí)必須同時(shí)切斷頸總和基底動(dòng)脈兩個(gè)系統(tǒng)的供血途徑，才能制備出有效的腦缺血模型[15]。用單側(cè)結(jié)扎的方法更有諸多好處，首先是可以進(jìn)行同體對(duì)照，即同一個(gè)腦的兩個(gè)半球(一側(cè)缺血，另一側(cè)不缺血)進(jìn)行組織學(xué)比較，比使用不同個(gè)體做對(duì)照更準(zhǔn)確和方便；其次，移開(kāi)動(dòng)脈夾就可以逆轉(zhuǎn)腦缺血或進(jìn)行再灌注，即使不用進(jìn)行再灌注動(dòng)物也可以存活較長(zhǎng)的時(shí)間，從而使這種模型與人實(shí)際發(fā)生的腦缺血更吻合，有利于治療試驗(yàn)和藥物評(píng)價(jià)試驗(yàn)的進(jìn)行[16]。而它的缺點(diǎn)在于長(zhǎng)爪沙鼠的前后交通支缺失的類型較多，從理論上來(lái)說(shuō)，只有前后交通支同時(shí)缺損才能用單側(cè)結(jié)扎的方法制備模型。

3.2 基因組DNA 文庫(kù)的特點(diǎn)

所謂基因組 DNA 文庫(kù)是指將某生物體的全部基因組 DNA 用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長(zhǎng)度范圍的 DNA 片段，與合適的載體體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽(yáng)性菌落，具有十分廣泛的用途，如用于分析、分離特定的基因片段，用以基因表達(dá)調(diào)控、人類及動(dòng)植物基因組工程的研究。

注：1和17：36 kb對(duì)照質(zhì)粒，2-16：隨機(jī)挑選的克隆株。

基因組DNA文庫(kù)具有代表性和隨機(jī)性雙重特點(diǎn)。其代表性是指文庫(kù)中所有克隆所攜帶的 DNA 片段重新組合起來(lái)可以覆蓋整個(gè)基因組，即可以從該文庫(kù)中分離任何一段 DNA。代表性是衡量文庫(kù)質(zhì)量的一個(gè)很重要的指標(biāo)。其隨機(jī)性是指文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中采用物理或化學(xué)方法隨機(jī)切割基因組DNA，保證克隆的隨機(jī)性，使每段DNA在文庫(kù)中出現(xiàn)的頻率均等。

參考文獻(xiàn)：

[1] Juliana B Casals, Naira CG Pieri, Matheus LT Feitosa,etal. The Use of Animal Models for Stroke Research: A Review[J]. Comp Med. 2011, 61(4): 305-313.

[2] Bing Chun Yan, Joon Ha Park, Bich Na Shin,etal. Neuroprotective Effect of a New Synthetic Aspirin-decursinol Adduct in Experimental Animal Models of Ischemic Stroke[J]. PLoS One. 2013; 8(9): e74886. Published online 2013 September 20. doi: 10.1371/journal.pone.0074886

[3] Ok Kyu Park, Choong Hyun Lee, In Koo Hwang,etal. Effects of repeated restraint stress on platelet endothelial cell adhesion molecule-1 immunoreactivity and protein levels in the gerbil hippocampus after transient cerebral ischemia[J]. Anat Cell Biol. 2010 March; 43(1): 54-63.

[4] 王鉅，盧靜，陳振文，等。長(zhǎng)爪沙鼠血液生理生化正常參考值的研究[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2004,12(2)：108-111.

[5] Wei Y, Hong Q, Chen D,etal. Permissibility of Mongolian gerbil for Angiostrongylus cantonensis infection and utility of this animal model for anthelmintic studies [J]. Parasitol Res, 2014, 2 , Epub ahead of print.

[6] Shcherbak NS, Galagudza MM, Yukina GY,etal. Morpho-functional changes of the pyramidal neurons in various hippocampal areas after the ischemic postconditioning[J]. Morfologiia, 2013, 143(3):7-13.

[7] Michal Malek, Malgorzata Duszczyk,etal. Hyperbaric oxygen and hyperbaric air treatment result in comparable neuronal death reduction and improved behavioral outcome after transient forebrain ischemia in the gerbil[J]. Exp Brain Res, 2013, 224(1):1-14.

[8] Sne?ana Rau? Balind, Vesna Selakovi, Lidija Radenovi,etal. Extremely Low Frequency Magnetic Field (50 Hz, 0.5 mT) Reduces Oxidative Stress in the Brain of Gerbils Submitted to Global Cerebral Ischemia[J]. PLoS One. 2014; 9(2): e88921. Published online 2014 February 19.

[9] V. Molina, Y. Ravelo, M. Noa,etal. Therapeutic Effects of Policosanol and Atorvastatin against Global Brain Ischaemia-Reperfusion Injury in Gerbils[J]. ndian J Pharm Sci, 2013, 75(6): 635-641.

[10] Heidi L. Lujan, Gurunanthan Palani, Jean D,etal. Targeted ablation of mesenteric projecting sympathetic neurons reduces the hemodynamic response to pain in conscious, spinal cord-transected rats[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2010 May; 298(5): 1358-1365.

[11] D E Levy, J B Brierley, F Plum. Ischaemic brain damage in the gerbil in the absence of 'no-reflow' [J]. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 1975, 38(12): 1197-1205.

[12] J. 薩姆布魯克，D W 拉塞爾. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M]科學(xué)出版社，2002: 15-17.

[13] M J Harrison, J Arnold, L Sedal,etal. Ischaemic swelling of cerebral hemisphere in the gerbil.[J] J Neurol Neurosurg Psychiatry. 1975 ,38(12): 1194-1196.

[14] M Fujishima, J Ogata, T SUGI,etal. Mortality and cerebral metabolism after bilateral carotid artery ligation in normotensive and spontaneously hypertensive rats[J]. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 1976 , 39(3): 212-217.

[15] Aysan Durukan, Turgut Tatlisumak. Preconditioning-induced ischemic tolerance: a window into endogenous gearing for cerebroprotection[J]. Exp Transl Stroke Med. 2010; 2: 2. Published online 2010 January 21.

[16] Iliana Sosa Teste, Yuneidys Mengana Tamos, Yamila Rodríguez Cruz,etal. Dose Effect Evaluation and Therapeutic Window of the Neuro-EPO Nasal Application for the Treatment of the Focal Ischemia Model in the Mongolian Gerbil[J]. Scientific World Journal. 2012; 2012: 607498. Published online 2012 May 22. doi: 10.1100/2012/607498.