比格犬ERβ剪切異構體ERβ419沉默表達載體的構建及篩選

甘 藝，趙彥斌，陳福軍，孫兆增，胡仲明，劉 冰，楊煥民，曾 林

(1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319；2.實驗動物中心，北京 100071；3.五棵樹經濟開發區動物衛生監督所，長春 130401)

比格犬ERβ419為該犬最新發現的ERβ剪切異構體，尚無其生物學功能的報道。ERβ419 cDNA序列由下丘腦-垂體-性腺軸提純得到，ERβ419由1257個堿基組成，編碼419aa，命名為ERβ419。研究未知基因的生物學功能通常借助于慢病毒介導RNAi重組載體，本實驗旨在篩選最有效的沉默表達載體，為后續探索比格犬ERβ419的生物學功能提供試驗材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：

無內毒素質粒小提試劑盒、GenFectinTM基因轉染試劑、為Biomed品牌產品，4×SDS上樣緩沖液為Solarbio品牌產品，胎牛血清、DMEM高糖培養基為Hyclone品牌產品，0.25%EDTA胰酶、PBS緩沖液、1 mol/L Tris-Cl、1.5 mol/L Tris-Cl為Solarbio品牌產品、抗MYC標簽兔單克隆抗體(GTX115046)為GENETEX品牌產品，抗GAPDH兔多克隆抗體(CW0101)、HRP標記兔二抗(CW0103)為康為品牌產品，DMSO為Invitrogen品牌產品，G418為Gibco品牌產品，T4 DNA Ligase和PrimeScript RT reagent Kit，SYBR?Premix Ex TaqTMII是TaKaRa品牌產品，胰蛋白胨、NaCl、酵母粉、脫脂奶粉等均為國產試劑。

1.1.2 菌種及細胞株：

pcDNA3.1-MYC-ERβ419重組質粒菌液及質粒、pGLV3/H1/GPF+Puro載體和HEK293T細胞由本實驗室凍存。

1.2 試驗方法

1.2.1 穩定表達ERβ419蛋白細胞株的構建

1.2.1.1 構建穩定表達ERβ419基因的細胞株

將細胞計數后適宜數量接種于6孔板中，高糖DMEM完全培養基(含有10%FBS，無雙抗)培養18～22 h。細胞鋪板底70%～80%時進行轉染。將4 μg pcDNA3.1-Myc-ERβ419重組質粒及10 μL GenFectinTM基因轉染試劑分別稀釋于50 μL 0.15 mol/L NaCl中，兩者再輕柔混合，室溫靜置5 min，混合液加入6孔板培養基中，培養24 h。

將瞬時轉染的細胞以適當倍數稀釋于100 mm細胞培養皿中，并設對照組細胞(同等數量的HEK293T細胞)；待細胞貼壁，并鋪至瓶底50%～70%時，加入含有青鏈霉素濃度為100 μg/ mL和G418濃度為800 μg/ mL的篩選培養基；每2～3日更換一次篩選培養基；待對照組細胞全部死亡，挑取單克隆細胞至96孔板中用完全培養基繼續培養；每2～3 d更換一次半濃度篩選培養基；篩選28 d后，可見有抗性的細胞團未發生死亡，生長狀態良好，即可停藥，擴大培養；當細胞量達到一定數量時，即可檢測目的蛋白的表達。

1.2.1.2 蛋白質印跡法檢測目的重組真核表達載體在HEK293T 細胞中的表達

收集待測細胞于離心管，每管加入500 μL 細胞裂解液，4℃全速離心30 min；取上清，用BCA法測定上清蛋白濃度；加適量4×SDS上樣緩沖液；沸水浴10～15 min，待10%SDS-PAGE膠干后，每個膠孔加入等質量蛋白；恒電壓電泳；蛋白膠恒電流轉印至0.45 μm PVDF膜；蛋白膜用5%脫脂奶粉封閉0.5～1 h后，按實驗需要剪裁蛋白膜；目的蛋白膜放入抗Myc標簽兔單抗1：1000稀釋液，GAPDH蛋白膜放入抗GAPDH兔多克隆抗體1：5000稀釋液，孵育4℃過夜；TBST洗膜3次，每次7 min；加入HRP標記兔二抗1：3000稀釋液，室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，每次7 min；待目的蛋白膜和GAPDH蛋白膜半干后，按原位置拼接，逐滴添加發光試劑盒A/B液等體積混合液，反應1 min，去除混合液后，即可顯影。

1.2.2 針對ERβ419基因慢病毒介導RNAi重組載體的構建

1.2.2.1 ERβ419基因shRNA序列的設計

依據siRNA設計原則，選擇ERβ419基因CDs序列為RNAi靶序列，在(網址http://www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/life-science/rnai.html)上針對每條目的基因設計出三對互補的siRNA模板序列，以5’-TTCAAGAGA-3’為發夾狀，每個基因設計三條特異性shRNA環形序列，并采用Blast軟件對選擇的三條靶序列進行同源分析，排除shRNA特異性地抑制其他基因片段的可能。再在shRNA堿基序列的5‘端和3’端分別加入限制性內切酶BamHI和EcoRI的酶切位點，最后將shRNA序列插入pGLV3/H1/GPF載體中；三條shRNA的寡核苷酸，分別為：

shRNAl:5’-GATCCgctgtgatgaattacagtaTTCAAGA GAtactgtaattcatcacagcTTTTTTG-3’;shRNA2:5’-GAT CCggtcgtgtgaaggatgtaaTTCAAGAGAttacatccttcacacgacc TTTTTTG-3’;shRNA3:5’-GATCCgctcttggcaacaacttca TTCAAGAGAtgaagttgttgccaagagcTTTTTTG-3’;shNC:5’-GATCCGttctccgaacgtgtcacgtTTCAAGAGAacgtgacac gttcggagaaCTTTTTTG-3’。將構建成功的重組質粒送往江蘇吉瑪生物公司合成慢病毒，病毒滴度為108。

1.2.2.2 慢病毒轉染病毒復數值(MOI值)的測定

將HEK293T細胞按3×103/孔細胞量接種于96孔板中；空白對照和實驗組分組鋪板后，添加無青鏈霉素的完全培養基至150 μL，培養18～22 h；取干凈1.5 mL離心管4支，分別加入90 μL新鮮完全培養基。向第1支離心管添加10 μL病毒原液，混勻后吸取10 μL加入第2支離心管中，以此類推，4支離心管中慢病毒濃度依次稀釋10倍，混合均勻；棄廢液，加入預混稀釋后的病毒液，空白對照組加入100 μL完全培養基，培養24 h；棄舊病毒液，加入150 μL 完全培養基，培養48 h；在熒光顯微鏡下觀察侵染細胞的熒光效率，并計算慢病毒的MOI值。

1.2.3 實時熒光定量PCR和Western Blot檢測ERβ419 RNAi慢病毒重組載體的干涉效率

1.2.3.1 引物熒光定量PCR特異性設計

根據GenBank中β-actin(AF021873)基因和比格犬ERβ剪切異構體ERβ419編碼區序列，利用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計，并且通過NCBI中Blast序列比對功能，初步檢測引物的特異性。引物由北京Biomed生物技術公司合成。

1.2.3.2 慢病毒侵染目的基因穩轉細胞系

按照2×105個/孔將穩轉細胞均勻鋪至細胞6孔板中，實驗分為正常培養組，無關序列組，shRNA1組，shRNA2組，shRNA3組。每孔加入完全培養基至2 mL，培養18～24 h；取干凈1.5 mL離心管4支，吸取1 mL新鮮完全培養基，加入適量病毒原液，混合均勻，棄實驗組舊培養基，加入病毒稀釋液，正常培養基組加入同等體積的完全培養基，培養24 h；棄廢病毒稀釋液，加入2 mL完全培養基，培養36 h；根據實驗需要，采用適當的試驗方法，處理侵染慢病毒的靶細胞。

1.2.3.3 慢病毒侵染目的基因穩轉細胞RNA的提取

用于提取RNA的耗材、塑料器皿均經0.1 % DEPC水浸泡24 h，高壓滅菌處理，氯仿、異丙醇及75%乙醇4℃預冷，6孔板中每孔加入1 mL Trizol，反復吹打細胞，將細胞-Trozol混合液收集用移液槍吸出，轉入1.5 mL離心管中，冰上放置5～10 min；加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩30 s，冰上放置10 min；12 000 g，4℃低溫離心15 min；將上層水相轉入新的1.5 mL離心管中，加入0.5 mL異丙醇，輕輕上下顛倒混勻，冰上放置10 min；12 000 g，4℃低溫離心15 min；棄上清，加入1 mL預冷的75%乙醇，用1 mL移液器吹起沉淀；7 500 g，4℃低溫離心5 min；棄去乙醇并瞬時離心，小心吸棄并蒸發管內液體；加入預冷的適量0.1% DEPC處理水溶解總RNA；儀器測定 A260/A280 吸光度，定量總 RNA 的濃度和純度。取1 μg RNA混合液加入0.1% DEPC 處理水配制的1%瓊脂糖凝膠槽中，150 V，10 min，檢測總RNA的完整性；根據實驗需要適當用0.1% DEPC 處理水稀釋 RNA。

1.2.3.4 反轉錄反應

按照PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)試劑盒的說明書在冰上配制操作。反應條件為37 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s，所得cDNA于-20℃保存。

1.2.3.5 實時熒光定量PCR(qPCR)檢測RNAi重組慢病毒載體干涉效果

按照SYBR?Premix Ex TaqTMII(TaKaRa)試劑的說明書在冰上配制操作。反應條件為預變性 95 ℃ 30 s；變性 95 ℃ 5 s，退火 58 ℃(β-actin)20 s/ 55 ℃(ERβ419)20 s，40個循環。融解曲線條件為95 ℃ 1 min；55 ℃ 1 min；55 ℃～94.6 ℃(每隔0.3℃采集一次熒光信號)循環133次，每組的樣本均設3次重復；反應結束后，軟件自動導出擴增動力學曲線、融解曲線和循環閾值(cycle threshold，Ct值)，由融解曲線判定PCR反應的特異性，根據標準曲線以及熒光曲線的Ct值計算定量結果。使用SPSS17.0統計軟件處理實驗數據，得到三條干涉序列對目的基因mRNA的抑制效果。

所有的樣品同期做三次重復，數值以x±s表示。標準曲線反應結果由IQ5儀器自動收集、分析和導出。自動顯示內參基因和目的基因的標準曲線方程、擴增效率R2以及直線方程系數(斜率)。

1.2.3.6 Western Blot技術檢測ERβ419 RNAi重組慢病毒載體干涉效果

方法同1.2.1.2操作步驟。通過Photoshop 7.0繪圖軟件對五組實驗組蛋白表達量差異進行分析。每組蛋白進行三次灰度分析，所得數據經SPSS17.0處理。

2 結果

2.1 篩選ERβ419陽性克隆細胞

經過長達28 d的G418篩選培養基的篩選，出現陽性克隆細胞。挑取至96孔細胞培養板中，利用半濃度G418篩選培養基的連續培養，細胞能夠正常生長，狀態良好，不再死亡，即為陽性克隆細胞。

2.2 Western Blot方法檢測ERβ419陽性克隆細胞中表達

Western Blot結果顯示，pcDNA3.1-MYC-ERβ419(列1)編碼蛋白質在HEK293T細胞中的的分子量大小為47×103，證明目的蛋白穩定且高效表達(圖1)。

注：1：pcDNA3.1-MYC-ERβ419；2：HEK293T細胞。

2.3 qRT-PCR和Western Blot檢測ERβ419干涉序列在mRNA水平和蛋白水平的定量分析

通過IQ5熒光定量PCR儀自帶軟件的數據和Photoshop 7.0灰度分析軟件，結合SPSS17.0分析軟件得到以下數據(表2.1)，表明，ERβ419-shNC(P> 0.05)、ERβ419-shRNA2(P> 0.05)、ERβ419-shRNA1(P< 0.01)和ERβ419-shRNA3(P< 0.01)差異極顯著，ERβ419-shRNA3的干涉效果最優。

表1 不同實驗組目的基因mRNA和蛋白的表達情況

3 討論

ERs首先是在哺乳動物體內的生殖系統器官中發現，并研究其對機體生殖生理的影響。隨著研究方向的拓展和研究內容的深入，ERs的生物學功能已不再單純的只作用于生殖系統，在骨骼、中樞伸進系統、心血管系統、內分泌系統、消化系統等方面也有涉及，對腫瘤的發生發展也有一定的影響。

ERs的高表達除了刺激生殖器官的發育和維持第二性征外，也可有效降低血液中的血脂含量，促進其恢復到正常水平，促進血管平滑肌松弛，降低血壓、保護心肌[1-2]，抑制自由基對機體傷害，直接和間接影響胰島素功能，調節血糖，有效預防阿爾茲海默病、帕金森病及骨質疏松癥等疾病[3-7]。

但ERs的高表達對機體也有負面影響，一些生殖系統方面的疾病都是因此而發生的。主要發生在卵巢、子宮和胸腺等實質器官。卵巢產生卵細胞和雌激素。卵巢分泌的雌激素與靶細胞上相應受體接觸和結合，激活有絲分裂原相關的生物學效應，誘導靶器官功能性亢進，最終導致卵巢疾病的發生[8]。卵巢癌變成為了最終且最惡劣的結果，其發病機制與雌激素信號通路有關。子宮作為雌激素調控的靶器官之一，其內膜細胞在妊娠期和發情周期發生周期性的增生和脫落。靶細胞受雌激素-ERs復合物的協同調節。實驗證明，對于子宮的發育及功能而言，ERs的正常表達尤為重要，但其異常激活對子宮的正常發育產生影響[9]。子宮內膜異位癥、子宮內膜腺癌、子宮肌瘤等疾病成為與ERβ相關的熱點子宮疾病。子宮肌瘤細胞內ERs和E2含量均較正常肌組織高，較高含量的雌激素刺激子宮肌瘤內的較高表達的ERs，導致子宮肌瘤的快速增生。乳腺組織中的血管分布密集，使不同時期分泌量不斷變化的雌激素到達間質組織、脂肪組織及上皮細胞腺狀體等靶細胞，進而在青春期、月經周期和妊娠期不同生理期，完成乳腺的激素調節和生理功能。雌激素信號通路誘導乳腺細胞增殖和凋亡等功能，乳腺癌形成則因該信號通路異常導致[10-12]。

RNAi因針對特定基因高效沉默其表達而通常應用于未知基因生物學功能的研究，成為現今研究基因生物學功能的重要工具。科學家們試圖通過調節雌激素或ERs的表達而起到預防和治療疾病的效果。RNAi技術就是一種極佳的臨床治療辦法。主要是設計針對致病基因或誘導致病基因mRNA的干涉序列，通過特異性dsRNA的靶向作用，沉默目的基因的表達，從而抑制了疾病的發生發展。試驗方法上便于操作，且高效持久，技術成熟。

比格犬雌性生殖系統方面常會出現繁殖能力下降、生殖器官病變等諸多問題，其主要原因是下丘腦-腦垂體-性腺軸中雌激素正負反饋調節機制發生異常。這種機制也受到ERs的表達量、表達水平與表達時間的調控[13-15]。ERs選擇性剪切機制產生的剪切異構體增加了蛋白質組多樣性，使雌激素信號在比格犬的生殖生理中發揮多種調節作用，了解ERs剪切異構體的生理學功能成為改善該犬生殖系統功能異常的研究重點。

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