Fah-/-小鼠對NTBC的藥物依賴性觀察

彭雨婷，武 昕，孔祥平，李紹林,劉光澤

(1. 解放軍第458醫院全軍肝病中心轉基因工程室，廣州 510602；2.沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院，沈陽 110016)

延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase, Fah)基因敲除小鼠，簡稱Fah-/-小鼠，是由Grompe等[1]建立的酪氨酸血癥Ⅰ(tyrosinemia type I, HT1)小鼠模型。該模型由于Fah的缺失，導致酪氨酸代謝受阻，毒性代謝產物蓄積，引起肝、腎的嚴重損傷[2-3]。2-(2-硝基-4-三氟甲基芐基)-環己烷-1,3-二酮(NTBC)藥物能夠抑制酪氨酸降解通路中4-對羥基苯丙酮酸雙氧化酶(4-HPPD)的活性，減少有毒代謝產物產生，臨床上用于治療高酪氨酸血癥[4]。Fah-/-小鼠存在廣泛而持續的肝損傷，可用于細胞移植、肝臟持續損傷、肝再生及肝癌的研究中[5-9]。本研究觀察Fah-/-小鼠對NTBC的藥物依賴性，更詳盡的掌握該模型的生物學特征，使該模型得以更有效的利用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級balb/c品系Fah-/-小鼠，體重23～25 g，10周齡公鼠24只，10周齡孕鼠51只，受贈于廈門大學，由解放軍第四五八醫院動物實驗中心飼養繁殖，飼養時飲用水中添加8 mg/L NTBC；SPF級balb/c品系野生型小鼠8只，體重23～25 g，10周齡，購自南方醫科大學實驗動物中心【SCXK(粵)2011-0015】，由解放軍第四五八醫院動物實驗中心提供及飼養【SYXK(軍)2012-0059】。正常進食。

動物飼養條件為：12h光照/12h黑暗節律，所有動物都用標準飼料和飲水飼養。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.1.2 主要試劑和儀器

2-(2-硝基-4-三氟甲基芐基)-環己烷-1,3-二酮 (NTBC)購自上海瑞博化學有限公司(CAS：104206-65-7)；蘇木素、伊紅購自福州邁新生物科技有限公司；中性樹脂封片劑購自武漢博士德公司；石蠟切片機購自德國Leica公司；恒溫烤箱購自北京醫療設備廠；正置顯微鏡購自日本Olymphas公司；不銹鋼高壓鍋購自福州邁新生物科技有限公司；顯微專業數碼圖像系統購自日本Olympus公司；十萬分之一天平購自日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 觀察NTBC對Fah-/-小鼠形態學和體重的影響

將24只10周齡Fah-/-小鼠分為三組：a.對照組(n=8)，服用NTBC；b.實驗組1(n=8)，間歇停藥，具體是停藥3周后，持續給藥2周，繼續停藥；c.實驗組2(n=8)，停藥不重復給藥。記錄小鼠生存狀態，形態學變化，每周稱重兩次，取各組體重均值，繪制體重曲線。

1.2.2 血清學檢測

Fah-/ -小鼠停藥組在第1,2,3,4,5,6周眼眶采血，離心分離獲得血清，檢測血清中ALB,AST,ALT,ALP水平[10]。

1.2.3 肝臟病理學檢測

1.2.3.1 制備組織切片

分別取Balb/c野生小鼠和NTBC停藥第0,1,2,3,4,5,6周的Fah-/-小鼠小鼠的肝臟相同部位(0.8 cm × 0.8 cm × 0.3 cm)，生理鹽水清洗，4%多聚甲醛固定24 h，常規石蠟包埋、切片。

1.2.3.2 蘇木素、伊紅(HE)染色

60℃烤片1 h，常規脫蠟水化，蘇木素染色5～10 min，水中返藍5～10 min，1%鹽酸酒精溶液分化 3～10 s，水洗2 min，伊紅復染5～10 min，水洗2 min，切片常規脫水透明干燥，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4 NTBC對Fah- / -小鼠繁殖情況影響

統計2013年4月至2014年4月一年內Fah- / -小鼠每窩產仔數量，與野生型窩產仔數進行統計學比較[11]。

1.2.5 數據處理及統計分析

利用spss19.0統計分析軟件對數據進行分析，統計分析采用重復測量方差分析和單因素方差分析。以α=0.05為檢驗水準，P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NTBC對Fah- / -小鼠形態學和體重的影響

對照組：Fah-/-小鼠飲用水中一直給予NTBC，體重穩步增長，健康存活。實驗組1：Fah-/-小鼠第一次停藥，體重進行性下降，3周后體重為初始體重的70%～80%，有顯著性差異(P< 0.05)，第3周飲用水中給與NTBC，第5周體重回升到初始體重后再次停藥，體重維持一周后再次呈進行性下降，小鼠最終存活時間為7～10周。實驗組2：從實驗開始，Fah-/-小鼠停止給予NTBC，體重呈進行性下降，小鼠最終存活時間5～7周。體重曲線見圖1。

Fah-/-小鼠停藥后活力逐漸降低，3周后出現弓背，毛刺，連續停藥5周后肢體行動不協調，易呈昏睡狀，且體重明顯減輕(P< 0.05)；如果再次給藥，其狀態、體重可逐漸恢復，生活狀態也有所改善；死亡時體重約為初始體重的60%～70%。

注：對照組：持續給藥NTBC；實驗組1：間歇停藥NTBC。實驗組2：持續停藥NTBC。

2.2 血清學指標檢測

停藥后，Fah-/-小鼠從第2周后ALB持續降低，ALT、AST、ALP指標逐漸升高，從第3周開始有明顯的統計學差異(P< 0.01)(見圖2)。

圖2 Fah-/-小鼠去除NTBC后血清學指標隨時間的變化曲線

2.4 肝組織病理學觀察

對照組1：Balb/c野生型小鼠肝臟，肝組織結構完整，肝小葉輪廓清晰，細胞排列緊密有序，細胞形態飽滿，胞漿充盈。對照組2：給藥NTBC，Fah-/-小鼠肝臟病理學形態與野生型相似，無炎性病癥。實驗組：隨著停用NTBC的時間的增加，肝臟正常組織結構消失，中性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞逐步浸潤，肝細胞由點狀壞死向灶狀、片狀壞死發展，肝細胞索排列紊亂，細胞界限不清晰，體積增大，核收縮，胞漿疏松。4周后胞質內可見大量的脂肪空泡和氣球樣變性，肝細胞大量壞死并伴有嚴重的炎性病癥和細胞凋亡(見圖3,彩插1)。

2.5 NTBC對Fah- / -小鼠繁殖情況影響

2013年4月到2014年4月，一年中繁殖Fah-/-小鼠51窩，平均窩產仔7.29只，Balb/c野生鼠平均窩產仔7.56只。P> 0.05，Fah-/-小鼠窩產仔情況與Balb/c野生型無統計學差異。終身服藥NTBC對Fah- / -小鼠繁殖能力無明顯影響。

3 討論

Fah-/-小鼠肝損傷原理同酪氨酸血癥Ⅰ型的發病機制。酪氨酸血癥Ⅰ型是一種少見的常染色體隱性遺傳病，又稱肝腎型酪氨酸血癥，患病率約為1/2000至1/10 000。其發病機制主要是由于肝、腎組織中延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)活性降低或缺失，導致酪氨酸代謝途徑的終端代謝發生障礙，不能正常代謝延胡索酸和乙酰乙酸。延胡索酰乙酰乙酸積累，其上游代謝物酪氨酸、4-羥基苯丙酮酸升高，使中間代謝產物馬來酰乙酰乙酸進一步積累，刺激產生旁代謝途徑。馬來酰乙酰乙酸和延胡索酰乙酰乙酸經旁代謝生成琥珀酰乙酰乙酸，后又再生成琥珀酰丙酮(SA)。這兩種旁代謝產物可以與蛋白質的巰基結合，二者含量增高造成嚴重的肝損傷及腎小管缺陷[13-14]，肝細胞和腎小管上皮細胞的細胞凋亡是這種疾病的主要特征。目前，臨床上通過琥珀酰丙酮診斷酪氨酸血癥Ⅰ型。

2-硝基-4-三氟甲苯-1,3環乙垸碘(NTBC)，又稱尼替西農，能夠抑制酪氨酸降解通路第二步4-對羥基苯丙酮酸雙氧化酶(4-HPPD)的活性，從而減少下游旁代謝途徑中的有毒代謝產物，起到治療作用。同時，NTBC抑制了酪氨酸向4-羥基苯丙酮酸的代謝，血酪氨酸增高，需控制蛋白質的攝取。總的來說，NTBC是替代肝腎移植治療酪氨酸血癥Ⅰ型最直接有效的方法。1992年，NTBC應用于臨床治療，生存率>90%。

Fah-/-小鼠通過敲除Fah基因，模擬酪氨酸血癥Ⅰ型癥狀，肝損傷原理來自酪氨酸血癥Ⅰ型的發病機制。Fah-/-小鼠在飼養過程中飲用水中添加8 mg/L的NTBC，不出現酪氨酸血癥Ⅰ型病癥，健康存活，生物學特性同野生型，是能夠穩定遺傳、易繁殖的小鼠模型。當NTBC停供，小鼠體重進行性降低，可低至初始體重的60%～70%，5～7周死亡，損傷持續穩定并未見自然恢復。生命活力3周后明顯降低，并伴有弓背、毛刺的現象；5周后開始，精神不濟，肢體不勤，弓背程度加重。肝損傷發生后重新喂藥，損傷停止加劇，體重逐漸恢復。說明Fah-/-小鼠對NTBC有嚴重藥物依賴性，不給與NTBC，Fah-/-小鼠不能存活，Fah-/-小鼠出現酪氨酸血癥Ⅰ型癥狀。但有實驗指出對Fah-/-小鼠進行多次的停藥喂藥實驗,反復的肝臟損傷和再生還可以誘導肝癌的發生[15-16]。

血清學指標檢測結果反映出肝臟呈持續性損傷。ALT與AST存在于肝細胞膜，能夠反映出肝實質細胞膜通透性的變化。停藥過程中，肝細胞逐漸壞死、凋亡，細胞膜破裂的同時釋放ALT與AST到血液，使血清中二者水平升高。ALT、AST、ALP水平與肝損傷程度呈正相關，ALP水平變化不如ALT、AST顯著；ALB水平與肝損傷程度呈負相關[12]，ALB降低呈現肝損傷加重。

停藥后肝組織病理學和形態學特征變化具有階段性，規律性，反映出不同階段的細胞損傷情況，小鼠肝臟損傷的時間和程度可以通過NTBC藥物的系統調節來進行控制。在連續給藥的情況下，Fah-/-小鼠的各項生理指標、生物學特性和生殖情況與野生型小鼠基本一致。當對小鼠進行斷藥處理后，逐漸有炎性細胞侵潤，發生炎癥反應，肝細胞開始大規模壞死，胞質內形成大塊脂肪空泡和氣球樣變性，停藥后期肝細胞壞死伴隨大量細胞凋亡，肝細胞發生細胞凋亡導致肝臟損傷。

Fah-/-小鼠對NTBC有依賴性，需終身服用，NTBC能通過抑制下游旁代謝途徑中的有毒代謝產物產生來阻止Fah-/-小鼠肝損傷；Fah-/-小鼠模型可以很好的模擬人類酪氨酸血癥Ⅰ型產生的各種癥狀，是研究該遺傳病的理想模型；同時，該模型形成的持續性不可逆的肝損傷，也適用于研究外源細胞在小鼠體內的定植狀況。因此，Fah-/-小鼠模型被廣泛應用于相關的肝病基礎研究、肝病細胞治療、肝臟持續損傷、肝再生及肝癌的研究領域。

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