腦缺血再灌注損傷后血腦屏障結構與功能的變化及丁苯酞預處理的干預作用*

紀海茹， 孔 維， 孔令偉， 趙淑敏△， 孔祥玉△， 王 偉

( 1承德醫學院脊髓損傷與修復研究室，河北 承德 067000； 2南陽醫學高等?？茖W校，河南 南陽 473000)

中風是目前導致死亡和神經功能障礙的主要原因，復雜的生化級聯反應參與了腦缺血時神經元損傷的主要過程，其中細胞內、外環境的病理生理改變直接影響了神經組織的損傷程度[1]。神經血管單元的結構改變，如血腦屏障(blood brain barrier，BBB)通透性發生變化，會引起細胞內、外環境的劇變，導致血管源性腦水腫，加重腦損傷[2]。腦缺血時，基質金屬蛋白酶類通過降解細胞外基質參與了BBB的破壞和血管源性腦水腫的過程，其中基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)居主導地位[3]。觀察腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury, CIRI)后MMP-9表達水平的變化對評價BBB功能的變化具有重要意義[4]。

丁苯酞(3-n-butylphthalide，NBP)在臨床主要應用于輕、中度急性缺血性腦卒中[5]，對CIRI有肯定的治療效果[6]，但對CIRI防護作用研究較少，本實驗將其預防性應用于CIRI大鼠，探討其對腦保護的作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

丁苯酞軟膠囊購自石藥集團恩必普藥業有限公司；伊文思藍購自TCI；免疫組化試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司；MMP-9Ⅰ抗購自宜康生物技術有限公司；RNasio Plus實時熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa。

2 動物分組、給藥方法及模型制備

成年SPF級雄性SD大鼠150只，體重260～280g，購于北京市維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號：SCXK(京)2012-0001]。

大鼠適應性飼養1周后，完全隨機分為5組，分別為假手術組(sham組)、模型組(IR組)、NBP預處理低劑量組(NBPⅠ組)、NBP預處理中劑量組(NBPⅡ組)和NBP預處理高劑量組(NBP Ⅲ組)，NBPⅠ、Ⅱ和Ⅲ組分別給予NBP 20、40和80 mg/kg，sham組和IR組給予等體積的生理鹽水。全部大鼠于造模前7 d開始灌胃給藥，每天1次。

末次灌胃24 h后，IR組和NBP各組參照Zea 等[7]的方法制備大鼠大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，假手術組僅分離右側頸總、頸外及頸內動脈，不插入線栓。術后單籠飼養并注意保暖。缺血2 h后將栓線抽提至頸外動脈殘端內行再灌注，再灌注24 h后作相應處理。

3 主要實驗方法

3.1腦水腫程度測定 采用干濕重法。各組均取6只大鼠麻醉后迅速取腦，分離出右側大腦，置于電子天平稱其濕重后，放到100 ℃烤箱中烤至恒重。腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

3.2BBB通透性測定 采用伊文思藍(Evans blue，EB)作為示蹤劑監測血腦屏障損傷程度的方法。每組取6只大鼠處死前1 h經尾靜脈注入2%的EB(4 mL/kg)，大鼠皮膚、球結膜等變藍表示注入成功。1 h后經心臟灌注預冷的生理鹽水直至右心房流出清亮液體，快速取缺血側腦組織稱濕重后放入5 mL甲酰胺溶液中，54 ℃恒溫培養箱中孵育24 h，1 000 r/min離心5 min，酶標儀測定其630 nm處的A值。甲酰胺溶液作為空白比色。腦組織EB含量(μg/g)=待測樣品EB含量(mg/L)×甲酰胺容量(mL)/腦濕重(g)。

3.3電鏡觀察血腦屏障結構的變化 大鼠麻醉后，經心臟快速灌注生理鹽水200 mL，待右心耳流出清亮液體時，再用2%戊二醛和4%多聚甲醛混合液灌注固定。取缺血側大腦皮質，常規透射電鏡樣品制備，半薄切片選區定位，超薄切片(片厚60 nm)鈾、鉛雙染，透射電鏡下觀察并攝片。

3.4免疫組織化學法檢測MMP-9蛋白的表達水平 采用SP法進行免疫組織化學染色。大鼠麻醉后，經左室快速灌注生理鹽水200 mL，隨后先快后慢地灌注4%多聚甲醛250 mL左右，快速斷頭取腦，常規脫水、透明、石蠟包埋，以5 mm厚度連續切片，切片經60 ℃烤片2 h后依次脫蠟、脫水，高壓鍋行抗原修復2 min后冷卻至室溫；PBS沖洗2次，每次5 min， 3% H2O2孵育10 min去除內源性過氧化物酶；PBS沖洗2次，每次5 min，滴加山羊封閉血清，室溫孵育10 min后傾去；滴加1∶200的MMP-9Ⅰ抗，室溫孵育2 h；PBS沖洗3次，每次5 min，擦干切片周圍水分后，滴加Ⅱ抗，37 ℃溫箱孵育20 min；PBS沖洗3次，每次5 min，擦干切片周圍水分后，滴加SP復合物即鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物，37 ℃溫箱孵育20 min；PBS沖洗3次，每次5 min；DAB顯色3～5 min，水洗終止顯色，蘇木素復染30 s，分化水洗，氨水返藍，脫水透明后中性樹膠封片。顯微鏡觀察，MMP-9蛋白的陽性表達為包膜和胞質內的棕黃色顆粒。采用JD801形態學圖像分析系統(Version 1.0)測定陽性細胞的平均灰度值，行半定量分析。平均灰度值與陽性細胞數呈反比。

3.5實時熒光定量PCR方法檢測MMP-9 mRNA表達 根據GenBank中MMP-9 的基因序列，以β-actin為內參照，設計合成引物。各引物的序列分別為：MMP-9的上游引物為5′-CGCTGACAAGAAGTGGGGTTT-3′，下游引物為5′-TACAGATGGTGGATGCCTTTTATG-3′；β-actin的上游引物為5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物為5′ -GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。根據TaKaRa公司提供的實時熒光定量試劑盒采用SYBR Green法對MMP-9 的mRNA表達水平進行測定?？偡磻w系為25 μL，包括Premix Ex TaqⅡ 12.5 μL cDNA 2 μL，滅菌蒸餾水8.5 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，放入實時定量PCR反應儀，反應條件：預變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火51 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，反應循環數為40，設置熔解曲線判斷是否有非特異性的擴增和引物二聚體的出現。用2-ΔΔCt的方法進行數據處理。

4 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，數據均以均數±標準差(mean±SD)的表示，不同組間的均數比較用單因素方差檢驗，各組間的兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 NBP預處理對CIRI大鼠腦組織含水量的影響

與sham組比較，IR組大鼠腦組織含水量顯著增加(P<0.01)；與IR組比較，NBP預處理組大鼠腦組織含水量均顯著減少(P<0.01)，且NBPⅡ、Ⅲ組較Ⅰ組減少更明顯(P<0.05)，但Ⅱ、Ⅲ組之間無顯著差異(P>0.05)，見圖1。

Figure 1. Water content alterations in the rats with different treatments. Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs sham;## P<0.01 vs IR; △P<0.05 vs NBP I .

2 NBP預處理對CIRI大鼠BBB通透性的影響

IR組大鼠的BBB通透性較sham組顯著增高(P<0.01)；NBP各組大鼠的BBB通透性較IR組均顯著降低(P<0.01)，且NBPⅡ、Ⅲ組比Ⅰ組降低更為顯著(P<0.05)，但Ⅱ、Ⅲ組之間差異不明顯(P>0.05)，見圖2。

Figure 2. BBB permeability alterations in the rats with different treatments. Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs sham;##P<0.01 vs IR; △P<0.05 vs NBP Ⅰ.

3 電鏡下觀察NBP預處理對CIRI大鼠BBB形態學的影響

Sham組毛細血管內皮細胞核膜、核仁形態規則，染色質密度均一，內皮細胞基膜清晰，厚薄均勻，緊密連接結構完好。IR組毛細血管明顯變形，管腔狹窄，血管周圍見大片電子空白區，內皮細胞大量溶解，殘存的線粒體空泡變性，多處基膜片狀溶解、斷裂，緊密連接融合、擴張。NBP各組均有不同程度的改善，NBPⅠ組血管周圍仍可見電子空白區，毛細血管基膜有溶解、斷裂現象，內皮細胞內線粒體空泡變性，緊密連接融合、擴張；NBPⅡ、Ⅲ組的情況較Ⅰ組有明顯改觀，見圖3。

Figure 3. BBB ultrastructure alterations in the rats with different treatments (×20 000).

4 NBP預處理對CIRI大鼠MMP-9 蛋白表達的影響

IR組的MMP-9蛋白表達平均灰度值(139.49±5.53)明顯低于sham組(179.52±6.35;P<0.01)；NBP各組MMP-9蛋白的表達平均灰度值較IR組均有不同程度增高(均P<0.01)，且NBPⅡ組(162.22±3.76)、NBPⅢ組(166.69±6.85)比NBPⅠ組(151.32±3.83)增高更為顯著(P<0.05)，但是NBPⅡ、Ⅲ組之間無顯著差異(P>0.05)，見圖4。

Figure 4. The protein expression of MMP-9 in the rats with different treatments (immunohistochemical staining, ×200).

5 NBP預處理對CIRI大鼠MMP-9 mRNA表達的影響

Sham組MMP-9有微量表達；IR組MMP-9的表達較正常組明顯升高(P<0.01)，NBP各組MMP-9含量均減少，且NBPⅡ、Ⅲ組比Ⅰ組減少更為顯著(均P<0.05)，但Ⅱ、Ⅲ組之間差異不明顯(P>0.05)，見圖5。

Figure 5. The mRNA expression of MMP-9 in the rats with different treatments. Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs sham; ## P<0.01 vs IR; △P<0.05 vs NBP Ⅰ.

討 論

目前研究表明，腦水腫是腦缺血再灌注損傷后BBB破壞所引起的主要表現。同時，BBB通透性增強會導致大量有害物質進入腦組織，引起細胞內外環境的改變，進一步加重腦水腫，導致神經元損傷[8]。MMP-9因有較強降解細胞外基質的能力，常被作為評價BBB完整性的檢測指標[1, 9-10]。EB作為一種示蹤劑可直接反映BBB的通透情況，腦含水量是評價腦水腫的直接指標[11]，可間接反映BBB的開放程度。電鏡下的觀察，是對血腦屏障形態學變化最有力的說明[12]。

本實驗腦缺血2 h再灌注24 h后，MMP-9表達明顯上調，EB含量和腦含水量大幅增加，電鏡攝片也顯示血腦屏障緊密連接融合、擴張，毛細血管明顯變形，內皮細胞大量溶解，多處基膜片狀溶解、斷裂，與文獻報道一致[13]。

丁苯酞是人工合成的消旋體，可改善腦缺血所致的腦損傷，有較強的抗缺血作用，能夠明顯縮小腦缺血的梗死體積，減輕腦水腫，抑制細胞凋亡，改善缺血區的微循環和腦能量代謝[14]。本實驗不再探討丁苯酞的治療作用，而是將其預處理于腦缺血再灌注損傷的大鼠，探討其對腦缺血的預防性保護作用。結果顯示，丁苯酞20 mg/kg預處理后，腦水腫減輕，BBB通透性降低，MMP-9表達下調，提示預防性應用丁苯酞后，小劑量即可起到保護作用。

為了探討丁苯酞預處理大鼠的合適劑量，我們又做了中、高(40、80 mg/kg)劑量的探索。結果發現，這2個劑量組與低劑量組相比，腦水腫進一步減輕，BBB通透性降低，MMP-9表達明顯減少，同時，中、高劑量組之間在上述指標中雖有數值的差異，但并無統計學的意義，提示應用40 mg/kg的丁苯酞預處理腦缺血再灌注損傷大鼠，可發揮較好的保護作用。

綜上所述，丁苯酞預處理可減輕腦水腫，減少BBB的通透性，發揮一定的預防性保護作用。其機制可能是通過調節MMP-9的表達，降低因血腦屏障通透性增加帶來的神經損傷。此外，本研究還采用了不同劑量的分組，找到了預處理應用于大鼠的最佳劑量，為臨床進一步應用提供有力的基礎支持。

[參 考 文 獻]

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