晚期糖基化終產物改變心肌細胞自發鈣火花形態學*

鄧建新， 劉文娟， 林澤勛， 王永輝， 閻德文

(深圳大學 1第一附屬醫院內分泌科， 2醫學院病理生理學教研室，廣東 深圳 518060; 3南方醫科大學病理生理學教研室，廣東 廣州 510515)

在心肌細胞的興奮收縮過程中，鈣離子起著至關重要的橋梁作用。心肌細胞興奮引起膜上的L-型鈣通道(L-type calcium channel，LCC)開放，鈣離子從胞外進入胞內。進入的鈣離子又激活雷諾丁受體(ryanodine receptor，RyR)鈣釋放通道，肌漿網中的鈣庫瞬時打開，使得胞內鈣濃度瞬間升高，最終引起細胞的收縮。鈣火花是內質網/肌漿網(sarcoplasmic reticulum， SR)上單個鈣釋放單元中雷諾丁受體隨機性的開放事件，其發現使得我們可以借助激光共聚焦顯微鏡實時觀察到鈣釋放單元(Ca2+release unit，CRU)激活和內質網/肌漿網鈣離子外流的情況，它是反映陣列RyR 的門控及其所形成的微鈣區域信號。“鈣火花”(Ca2+spark)及其相關鈣信號事件是近百年來生理學研究領域的一個重大的發現，它們揭示了鈣信號局部控制的新機制，以及細胞內精細的鈣信號結構體系。

近年來，糖尿病的發病率在我國急劇上升，目前已有超過9 400萬的糖尿病患者，此外尚有約 1.5億中國人處于糖尿病前期，中國已成糖尿病患者大國[1]。晚期糖基化終產物(advanced glycation end products, AGEs)是機體在長期高糖狀態時蛋白質和還原糖之間經過非酶性糖基化反應生成的物質，它被認為是糖尿病最主要的致病物質之一。很多的疾病如糖尿病、炎癥、腎功能衰竭等都可以引起AGEs的聚集。已有的研究表明AGEs 主要通過與其受體RAGE作用從而促發氧化應激反應，導致 ROS 大量產生, 促進一系列炎癥因子的表達，進而引起細胞的損傷。但是AGEs對心肌細胞鈣信號調控機制尚不完全清楚。

材 料 和 方 法

1 材料

1～3 d SD乳鼠20只，購于南方醫科大學實驗動物中心。AGEs由南方醫科大學黃巧冰教授惠贈；膠原酶II購于Worthington；5-溴脫氧尿嘧啶和胰蛋白酶購于Sigma；DMEM培養基和 新生牛血清為Gibco產品； Fluo-4 AM購于Invitrogen；其余無特別說明為國產分析純。主要的儀器為Zeiss LSM-780倒置共聚焦顯微鏡(Zeiss)。

2 方法

2.1乳鼠心肌細胞的原代培養 用胰蛋白酶消化方法[2]把1～3 d 齡 SD大鼠心室肌消化成單細胞懸液。經差速法貼壁心肌細胞：37 ℃、5 % CO2培養箱中培養60～90 min，分離純化心肌細胞。將純化的細胞按1×105細胞數接種于35 mm培養皿中(培養皿事先加入了共聚焦專用玻片),培養24 h后饑餓2 h，然后加入不同濃度的AGEs進行刺激，8 h后進行鈣火花檢測實驗[3]。

2.2熒光染料的加載 把鈣熒光指示劑Fluo-4 AM(5 μmol/L)與細胞共同孵育10 min(室溫、避光)，之后清洗3次，以去除多余的熒光染料。將加載好熒光染料的細胞置于Zeiss LSM-780 倒置共聚焦顯微鏡系統的載物臺上，以臺氏液灌流細胞等待實驗。

2.3鈣火花的采集 由于鈣火花的發放速度快、時程短，因此采用線掃描的方式進行捕捉。 在400倍鏡下，固定激光強度為2%，隨機選取橫紋清晰、無自主跳動的細胞，采樣速率為每線3.07 ms，采集1 000條線，在采集過程中放大倍數和采樣速度應盡量保持一致以便于數據統計分析。激發光波長為488 nm，收集波長為505 nm以上的發射光。鈣火花圖像采用IDL 6.3軟件進行處理。參照以往的方法[4]，選取無鈣信號釋放區域進行靜息鈣水平的分析。

3 統計學處理

用SPSS 13.0軟件分析。統計方法為單因素方差分析，方差齊時采用LSD法，方差不齊時組間比較采用Welch檢驗。數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 AGE增加鈣火花的發放頻率

結果表明,AGEs可以顯著增加心肌細胞自發鈣火花的發放頻率。對照組的鈣火花發放頻率為1.56±0.13 (n=274), 10 mg/L AGEs 組為2.31±0.24 (n=258)，50 mg/L AGEs 組自發鈣火花的發放頻率為4.68±0.30 (n=180)，150 mg/L AGEs 組鈣火花的發放頻率為3.59±0.25 (n=158),見圖1。

Figure 1. AGEs increased spontaneous calcium sparks frequency.Mean±SEM.**P<0.01 vs control.

2 AGEs 改變自發鈣火花的形態

在觀察AGEs 調控鈣火花發放頻率的同時，發現AGEs可以影響鈣火花的形態學特性。選取各組的鈣火花通過三維重組技術后可以看出，AGEs使得鈣火花的大小減小,見圖2。在分析的鈣火花動力學時，我們著重分析鈣火花的4個特征：鈣火花峰值幅度(amplitude, F/F0)、空間半高寬(full width at half maximum, FWHM；空間變化曲線中高于峰值1/2的曲線部分所對應的距離計算)、持續時程(full du-ration at half maximum, FDHM；時間變化曲線中高于峰值1/2的曲線部分所持續的時間)和上升時間(rise time，RT；指鈣火花起始處到峰值處所經歷的時間)均有不同程度的變化,見表1。

Figure 2. AGEs changed spontaneous calcium sparks morphology. A: typical calcium spark line scan image; B: single three-dimensional diagram of recombinant calcium sparks

3 AGEs增加心肌細胞靜息期肌漿網內鈣水平

結果顯示，AGEs組略微增加靜息期內鈣離子水平，鈣離子水平對照組為48.25±1.57，10 mg/L AGEs組(51.04± 2.01)與對照組相比差異不明顯，50 mg/L AGEs組(53.45±2.28)和150 mg/L AGEs 組(60.27±4.28)均較對照組明顯升高(P<0.05或P<0.01),見圖3。

表1 AGEs改變鈣火花形態學指標

Figure 3. Effects of AGEs on cardiomyocyte resting Ca2+.Mean±SD.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

討 論

在本實驗中，我們發現AGEs可以增強肌漿網中RyR的活性，使得心肌細胞自發鈣火花發放頻率增加,并使鈣火花的形態發生改變。鈣火花形態反映了豐富的信息，包括CRU 的門控、釋放的離子流、微觀尺度的鈣擴散及這些過程的生理調控。鈣火花反映的是單個或少數幾個RyR的同步開放。鈣火花的發放頻率及功能特性反映舒張期RyR的功能活動，同時還反映SR鈣庫和胞漿鈣的平衡狀態[5]。鈣火花的發現，使人們得以在完整細胞更接近生理條件下研究RyR的功能。

正常靜息心肌細胞，RyR通道主要處于關閉狀態，只有零星的鈣火花發放，有利于維持正常的SR鈣庫容量。但若病理刺激引起舒張期RyR通道開放異常增加，勢必導致SR鈣漏流增強，SR鈣庫容量減少，使心肌收縮力減弱。SR鈣漏流還引起心肌細胞鈣超載，從而造成心肌細胞的損傷。近些年來，一系列研究工作發現心力衰竭的心肌細胞SR鈣漏流增加，是引起心衰的一個重要機制[4，6-9]。

借助鈣火花成像技術，Yaras等[10]研究發現，鏈脲佐菌素誘導糖尿病大鼠5周時離體心肌細胞鈣火花頻率顯著增加。與此同時，還發現靜息期胞漿鈣濃度升高(鈣超載)，收縮期鈣瞬變幅度降低，心肌收縮力減弱。AGEs對離體心肌細胞的作用與之相似，因此，我們有理由相信，AGEs引起的鈣火花增加介導的鈣漏流的產生，進而引起肌漿網鈣庫的下降，另外AGEs引起的鈣超載也對心肌細胞造成損傷，最終引起收縮期心肌收縮力的下降。這可能是糖尿病性心肌病心功能不全的重要機制。

[參 考 文 獻]

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