Rock可能通過抑制PI3K/Akt通路促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡*

董家龍， 李菊香， 孫國(guó)芳， 洪 葵

(1南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330006； 2贛州市南康區(qū)第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，江西 贛州 341400)

Rho相關(guān)的卷曲螺旋蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil protein kinase，ROCK)是新近發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的激酶，是激活的caspase-3的直接裂解產(chǎn)物，ROCK有2個(gè)亞單位，即ROCK1和ROCK2。研究表明ROCK與心肌損傷、心肌細(xì)胞凋亡及心力衰竭有關(guān)聯(lián)[1]。然而，ROCK在缺血性心肌損傷中與磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通路有何關(guān)系？目前尚不清楚。本研究旨在觀察缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡過程中，ROCK1和ROCK2的變化及其與心肌PI3K之間的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 材料

Sprague-Dawley乳鼠(出生1～3 d) 雌雄不限，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供(動(dòng)物合格證：醫(yī)動(dòng)字 021-9602)。DMEM高糖培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS)購(gòu)自HyClone；胰蛋白酶購(gòu)自Sigma；山羊抗鼠ROCK-1Ⅰ抗、山羊抗鼠ROCK-2Ⅰ抗、兔抗鼠caspase-3Ⅰ抗、兔抗鼠p-PI3KⅠ抗、兔抗鼠PI3KⅠ抗均購(gòu)自Santa Cruz；抗α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德；MTS溶液購(gòu)自Promega；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物有限公司

2 方法

2.1原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 取健康乳鼠，利用0.08%胰酶消化3次后，離心棄胰酶，接著用1%II型膠原酶消化心肌組織1～2 h，至組織消化完全，以含15% FBS的DMEM培養(yǎng)基(1∶1)終止消化，室溫下離心5 min，收集細(xì)胞沉淀以15% FBS的DMEM培養(yǎng)基充分重懸，200目濾網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液至培養(yǎng)皿，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，經(jīng)差速貼壁2 h后，加入0.1 mmol/L 5’-BrdU抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，以1×109/L的細(xì)胞密度接種于35 mm的培養(yǎng)皿中，待心肌細(xì)胞生長(zhǎng)接近匯和狀態(tài)及呈現(xiàn)同步搏動(dòng)時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。48 h后，取有心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的玻片，用37 ℃ PBS漂洗，4%多聚甲醛固定，加大鼠抗α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白單克隆Ⅰ抗(1∶50)，于4 ℃濕盒過夜，加FITC羊抗小鼠IgG (1∶50)，孵育30 min，PBS洗2次,DAPI染核，封片劑封片，顯微鏡下觀察。

2.2心肌細(xì)胞缺氧模型制備及各種條件培養(yǎng) 心肌細(xì)胞生長(zhǎng)接近匯合狀態(tài)，呈現(xiàn)同步搏動(dòng)時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。模擬缺血溶液(NaH2PO40.9 mmol/L, NaHCO36.0 mmol/L, CaCl21.8 mmol/L, MgSO41.2 mmol/L, HEPES 20 mmol/L,NaCl 98.5 mmol/L, KCl 10.0 mmol/L,乳酸鈉40 mmol/L， pH 6.5)以95% N2～5% CO2預(yù)飽和1 h，將培養(yǎng)的細(xì)胞以模擬缺血液置換正常培養(yǎng)基，放入密閉氣體盒中缺氧；以DMEM培養(yǎng)基于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),為有氧培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為5組：常規(guī)培養(yǎng)組、缺氧1 h組、缺氧3 h組、缺氧6 h組和缺氧9 h組。細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)干預(yù)后，檢測(cè)各時(shí)點(diǎn)相關(guān)指標(biāo)：細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞存活率及ROCK-1、ROCK-2、活化caspase-3、p-PI3K和PI3K的表達(dá)情況。

2.3MTT法檢測(cè)心肌細(xì)胞成活率 將細(xì)胞種植在96孔板中，空白調(diào)零孔只加不含細(xì)胞的培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)處理后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀(Labststems)測(cè)定492 nm處各孔吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A)×100%。

2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 用胰酶消化收集上述各組細(xì)胞， PBS洗滌細(xì)胞2次，再用500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，分別加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，最后用FACS Calibar流式細(xì)胞儀(Beckton Dickinson，)檢測(cè)。

2.5全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH) 各組實(shí)驗(yàn)干預(yù)后取心肌細(xì)胞培養(yǎng)液 400 μL,利用全自動(dòng)生化分析儀(Beckman)測(cè)定LDH活性。

2.6Western blotting 用RIPA法取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取20 μg進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白。蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上,3% BSA液4 ℃封閉過夜。膜分別用ROCK1、ROCK2、caspase-3活化片段、p-PI3K和PI3K的Ⅰ抗 (1∶200) 孵育,4 ℃ 過夜, Ⅱ抗孵育2 h,DAB顯色照相。結(jié)果用LabWork 3.0 UVP軟件, 以目的條帶與β-actin的灰度值進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)6次。用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 12.0進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 心肌細(xì)胞的鑒定

倒置顯微鏡下觀察：細(xì)胞呈片狀有節(jié)律的搏動(dòng)，細(xì)胞致密，高度折光，細(xì)胞核小，常有1～2個(gè)核仁，有的細(xì)胞呈不規(guī)則的星形，并伸出偽足。免疫組化結(jié)果顯示，抗體陽(yáng)性心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)有綠色熒光，見圖1。

2 心肌細(xì)胞存活率、凋亡率及上清液LDH的變化

缺氧1 h、3 h、6 h、9 h后，心肌細(xì)胞凋亡率和上清液LDH活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.01),細(xì)胞存活率均低于對(duì)照組(P<0.01),見圖2、表1。

Figure 1. Cardiomyocyte identification observed by fluorescence microscopy(×100).

Figure 2. Cardiomyocyte apoptosis induced by hypoxia at different time points.

表1 不同時(shí)點(diǎn)心肌細(xì)胞存活率、凋亡率和上清液LDH活性的變化

3 心肌細(xì)胞中ROCK-1、ROCK-2蛋白表達(dá)

ROCK-1在缺氧1 h 即開始升高，在6 h 表達(dá)達(dá)高峰，在9 h開始回落，均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。ROCK-2與在缺氧1 h即開始升高，在3～6小時(shí)表達(dá)達(dá)高峰，在9 h開始降低，均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，與ROCK-1的表達(dá)有平行對(duì)應(yīng)關(guān)系,見圖3。

4 心肌細(xì)胞中PI3K和p-PI3K的表達(dá)

PI3K在不同的缺氧時(shí)點(diǎn)表達(dá)無明顯變化，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。p-PI3K蛋白的表達(dá)在缺氧1 h開始升高，在3 h左右達(dá)高峰，缺氧9 h后回落，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。

Figure 3. Expression of ROCK-1 and ROCK-2 in cardiomyocytes subjected to hypoxia for different time.1： control； 2： hypoxia 1 h； 3： hypoxia 3 h； 4： hypoxia 6 h；5： hypoxia 9 h. Mean±SD.n=6. *P<0.05 vs control.

Figure 4. Expression of PI3K and p-PI3K in cardiomyocytes subjected to hypoxia for different time. 1： control； 2： hypoxia 1 h； 3： hypoxia 3 h； 4： hypoxia 6 h； 5： hypo-xia 9 h. Mean±SD.n=6. *P<0.05 vs control.

5 缺氧后心肌細(xì)胞中caspase-3蛋白表達(dá)

Caspase-3活化片段在缺氧1 h開始逐漸升高，在隨后觀察的時(shí)點(diǎn)內(nèi)持續(xù)處于高表達(dá)狀態(tài)，與對(duì)照組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),這與心肌細(xì)胞的凋亡率和培養(yǎng)液中的LDH的變化是一致的,見圖5。

討 論

研究表明，ROCK 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，至少有2種亞型，即ROCK1和ROCK2。ROCK參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的一些基本功能，如收縮、游走黏附、增殖和凋亡等[2],ROCK-1和ROCK-2幾乎在全身各組織都有表達(dá)，兩者在心臟和血管平滑肌表達(dá)均較多，ROCK-2 mRNA在大腦和骨骼肌表達(dá)較多。靜息狀態(tài)下的ROCK沒有酶活性，因?yàn)镽OCK的激酶活性可能存在一種自我抑制的機(jī)制，即通過自身的折返使其催化中心(激酶域)覆蓋，這樣使得該激酶的激酶域與ATP的親和力受到抑制或使得其下游區(qū)域不能與底物結(jié)合而不被激活。ROCK的活性受細(xì)胞外信號(hào)和一些胞漿蛋白的調(diào)節(jié),ROCK接受Rho傳遞的活化信號(hào)，發(fā)生多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的磷酸化而激活，并介導(dǎo)其下游一系列磷酸化/脫磷酸化反應(yīng)。心力衰竭和冠心病發(fā)病過程中伴隨著心肌細(xì)胞凋亡[3]，近年來，認(rèn)為ROCK與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)系[4]。研究發(fā)現(xiàn)在心肌細(xì)胞中，ROCK1可以被caspase-3激活，ROCK1是活化的caspase-3的直接裂解底物，而激活的ROCK1又可以反饋激活caspase-3，如此形成惡性循環(huán)[5]。

Figure 5. The expression of cleaved caspase-3 in cardiomyocytes subjected to hypoxia for different time. 1： control； 2： hypoxia 1 h； 3： hypoxia 3 h； 4： hypoxia 6 h； 5： hypoxia 9 h. Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs control.

本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧損傷能引起心肌細(xì)胞凋亡增加及引起caspase-3活化，缺氧早期可以引起磷酸化的PI3K蛋白表達(dá)增加，這可能是心肌細(xì)胞抗凋亡的的保護(hù)機(jī)制，在繼續(xù)缺氧過程中磷酸化PI3K開始下降至基本消失。與此同時(shí)，缺氧也可以引起ROCK-1和ROCK-2蛋白增加，并且在缺氧6 h左右表達(dá)達(dá)高峰，心肌細(xì)胞凋亡率也隨著缺氧時(shí)間而逐漸增加，p-PI3K在ROCK表達(dá)達(dá)高峰時(shí)開始回落， 提示ROCKs的激活可能抑制了p-PI3K的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了缺氧心肌細(xì)胞的凋亡。

PI3K/Akt信號(hào)通路是近年來發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞增殖調(diào)控的重要信號(hào)通路，近來研究資料表明PI3K/Akt通路是許多生命活動(dòng)中關(guān)鍵的信號(hào)分子，PI3K/Akt介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂、分化和凋亡等活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號(hào)途徑在缺血預(yù)適應(yīng)、缺血再灌注損傷中被激活，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。研究表明PTEN是一種磷酸(酯)酶，是新近證實(shí)的ROCK的一種底物,其可以使磷酸肌醇底物去磷酸化，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起了很重要的作用，尤其在PI3K/Akt信號(hào)通路中，它是PI3K上游區(qū)域的一個(gè)負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，與細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)，蛋白質(zhì)的合成，轉(zhuǎn)錄子的調(diào)節(jié)及細(xì)胞存活有關(guān)。PTEN可以通過ROCK而磷酸化，進(jìn)而被激活。有文獻(xiàn)表明ROCK抑制劑保護(hù)心臟是通過抗細(xì)胞凋亡的作用，這是ROCK抑制劑減弱了缺血再灌注引起的Bcl-2下調(diào)及通過激活PI3K/Akt/eNOS途徑來保護(hù)心臟，這種保護(hù)作用可以被PI3K抑制劑LY294002完全阻斷；在心肌的局部缺血/再灌注損傷中，心肌中RhoA的表達(dá)及其后ROCK活性均有增加,在缺血再灌注早期給予ROCK抑制劑可以顯著減少SD大鼠心肌梗塞的面積及心肌細(xì)胞凋亡率[6]。綜上所述， ROCKs可能參與了缺氧致心肌細(xì)胞凋亡的過程，其機(jī)制可能是通過抑制p-PI3K信號(hào)途徑進(jìn)而促進(jìn)缺氧心肌細(xì)胞凋亡；ROCK可能通過激活caspase-3引起缺氧心肌細(xì)胞凋亡。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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