黃蘭姍， 黃子凌， 馮振博， 陳 罡， 危丹明

(廣西醫科大學第一附屬醫院病理科，廣西 南寧 530021)

特異性蛋白(specificity protein，Sp)家族屬于特殊轉錄因子，含有高度保守的DNA結合區域，在羧基端有3個串聯的 Cys2His2型鋅指結構域，能與GC/GT盒及基本的轉錄元件結合。轉錄因子Sp家族通過調控下游靶基因，廣泛參與細胞內的轉錄調控，涉及幾乎所有細胞功能，包括細胞增殖、分化、凋亡和腫瘤形成等。其中，Sp3在多種組織中廣泛表達，其轉錄調控作用具有特殊性，扮演著轉錄激活或者轉錄抑制的雙重角色。家族成員在結構與功能上既有相似性也有各自的特性，在Sp家族中，前人的研究多集中于Sp1，而關于Sp3調控的下游基因情況的研究報道甚少。

β-catenin作為連環蛋白家族中的一員，具有介導細胞黏附和Wnt/β-catenin信號轉導的雙重活性，其在原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發生發展中的作用倍受關注，研究多集中于β-catenin蛋白的過表達、磷酸化、基因突變等[1-2]。部分學者發現Sp家族與Wnt/β-catenin信號通路之間存在聯系，提出β-catenin是Sp調控的下游基因之一[3]。本課題組前期實驗亦發現，在肝癌細胞株HepG2中運用RNAi下調Sp3后，β-catenin的表達隨之減少，而且細胞增殖能力明顯減弱，周期阻滯在G0/G1期[4]；在裸鼠人肝癌種植瘤模型中，Sp3可通過上調β-catenin及其下游基因MMP-9表達，同時下調E-cadherin的表達，增強人肝癌細胞的侵襲能力[5]；基因芯片結果亦提示肝癌細胞株HepG2中Sp3下調后β-catenin的變化與前期實驗一致[6]。這些均提示在HCC中Sp3與β-catenin存在聯系，Sp3作為轉錄因子可能直接或間接調控β-catenin的表達，然而具體聯系與機制尚未清楚。本研究擬在前期研究的基礎上，通過雙螢光素酶報告基因實驗進行Sp3與β-catenin啟動子結合的預測與驗證，初步研究轉錄因子Sp3對β-catenin啟動子活性的影響，從而探索Sp3對Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin的作用機制，為HCC中Sp3的調控網絡及作用原理提供依據。

材 料 和 方 法

1 材料

人胚腎上皮細胞HEK-293T(中國科學院上海細胞庫)；DMEM培養基和胎牛血清(Wisent)，Opti-MEM不完全培養基(Gibco)；Lipofectamine2000(Invitrogen)；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega)；β-catenin啟動子報告基因質粒(pGL3-β-catenin)、Sp1表達質粒(pcDNA3.1-Sp1)、Sp3表達質粒(pcDNA3.1-Sp3)和陰性對照質粒(pcDNA3.1)由上海吉凱基因公司構建，PRL-TK質粒由Promega提供。

2 主要方法

2.1生物信息學分析 在NCBI上查找人β-catenin的基因信息，預測啟動子區域為轉錄起始位點與上游2 000 bp之間，利用TFSEARCH軟件預測、分析此啟動子區域的轉錄因子結合位點，根據轉錄因子Sp3結合位點的情況截取啟動子序列進行報告基因質粒的構建。

2.2細胞培養與瞬時轉染 293T細胞培養于10%胎牛血清的高糖DMEM培養液, 于37 ℃、5% CO2和飽和濕度的CO2恒溫培養箱。細胞分3組：實驗組(啟動子+轉錄因子質粒)、陰性對照組(啟動子+陰性對照質粒)和mock對照組。將處于對數生長期的293T細胞接種于96孔板中，待細胞長至70%～80%融合率時以脂質體法轉染。pGL3-β-catenin分別與pcDNA3.1-Sp1、pcDNA3.1-Sp3、pcDNA3.1(劑量梯度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 μg)轉染293T細胞，觀察Sp1或Sp3單獨轉染對β-catenin啟動子活性的影響。根據實驗結果選取對β-catenin啟動子轉錄活性的促進作用最強的劑量，后以該總量的pcDNA3.1-Sp1和pcDNA3.1-Sp3，設計不同比例，觀察Sp1與Sp3共同轉染對β-catenin啟動子活性的影響。以上轉染均加入內參照pRL-TK質粒。轉染48 h后進行螢光素酶活性的檢測。

2.3雙螢光素酶報告基因檢測 96孔板內每孔加入30 μL 1×細胞裂解液(PLB)，室溫條件下用搖床充分裂解20 min。將細胞裂解液轉移至1.5 mL EP管，加入100 μL 螢火蟲螢光素酶底物，混合均勻，用單管發光計檢測每個樣本的發光強度，即為螢火蟲螢光素酶活性(firefly luciferase activity，FLA)。每管再加入100 μL 反應終止液(Stop & Glo)，用單管發光計檢測每個樣本的海腎螢光素酶活性(Renillaluciferase activity，RLA)。將FLA除以RLA進行標準化，再計算實驗組相對于陰性對照組的相對螢光素酶活性。

3 統計學處理

采用SPSS 16.0軟件分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，各組樣本均數比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。實驗重復3次以上。

結 果

1 人β-catenin基因啟動子內Sp結合位點預測

通過生物信息學分析，發現β-catenin基因CTNNB1啟動子區域存在3個Sp1結合位點，無Sp3特異性結合位點。由于Sp3與Sp1結構比較相似，能識別并以相似的親和力結合經典的Sp1結合位點，故選擇此3個位點進行研究。以下為截取的啟動子片段(410 bp，劃線部分為3個Sp1結合位點)：(-410 bp)CCGAGCGGTACTCGAAGGCCGGGGCCGA-GATGCCACCTTCCGCAGGCCGCGGGAAAGGCGCGCC-GAGTCCTGCAGCTGCTCTCCCGGTTCGGGAAACGC-GCGGGGCGGGGGCGTCGGGCTTGGGACAGGGGAG-GATACCAGGGCCACCTTCCCCAACCCAGGCCGCG-GGGGCCCGGCCTCCCCGATGCAGACCACAGCGCCC-TCACGGGCTGCCCTCAGGCCGCGCAGCGGGCAGCC-GCCAGCCGTCACCCCGGGGAGCGTCCGTGGGGTGC-CCAGGCACCCCACCCCGGCCCGGGGCGCTCAGACG-GCAGCAGACTGCTGGGCGGCGCGGGGACTACTTTC-CAC-CGCCCCCTCGCGCCCCGCCCCTTGTCCTCGCG-CGGCGGAACGCTCCGCGCTGCGCCGGTGGCGGC(-1 bp)。

2 Sp1或Sp3單獨轉染對β-catenin啟動子活性的影響

2.1Sp1對β-catenin基因啟動子(-410/-1 bp)轉錄活性的影響 雙螢光素酶報告基因檢測結果顯示，Sp1表達質粒pcDNA3.1-Sp1在0.4～0.5 μg時增強啟動子活性，并且在0.4 μg時能提高啟動子的活性2.4倍，但與陰性對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

Figure 1. Effect of Sp1 on transcription activity of β-catenin promoter (-410/-1 bp).Mean±SD.n=3.

2.2Sp3對β-catenin基因啟動子(-410/-1 bp)轉錄活性的影響 雙螢光素酶報告基因檢測結果顯示，Sp3表達質粒pcDNA3.1-Sp3在0.1 μg時抑制β-catenin啟動子活性，而其它劑量均提高啟動子活性，尤其在0.4 μg時能提高啟動子的活性5.3倍，與陰性對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. Effect of Sp3 on transcription activity of β-catenin promoter (-410/-1 bp).Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs pcDNA3.1.

3 Sp1和Sp3共同轉染對β-catenin啟動子活性的影響

雙螢光素酶報告基因檢測結果顯示，共同轉染時，隨著Sp3/Sp1比例的遞增，即Sp3濃度增加，Sp1濃度降低，β-catenin啟動子活性相近，無明顯變化。pcDNA3.1-Sp3轉染量為0.4 μg 時啟動子活性最強，與陰性對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. Effect of co-transfection of Sp1 and Sp3 on transcription activity of β-catenin promoter (-410/-1 bp). Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs pcDNA3.1.

4 比較Sp1、Sp3單獨轉染與共同轉染對β-catenin啟動子活性的影響

單獨轉染Sp1 0.3 μg時，相對活性值為0.4，單獨轉染Sp3 0.1 μg時，相對活性值為0.5，兩者共同轉染時相對活性值為3.5，見圖4A，此組為共轉染后轉錄活性變化最大者，其它組亦出現共轉染后啟動子轉錄活性增強，見圖4B、C。

討 論

特殊轉錄因子僅與其靶啟動子中的順式作用元件結合，從而對基因的表達起增強或抑制作用，螢光素酶報告基因實驗是檢測這類轉錄因子和其靶啟動子中的特異順序結合的重要手段。結合前期實驗結果，我們根據文獻以及軟件預測結果(β-catenin啟動子區域存在3個Sp1結合位點)，選擇-410 bp到-1 bp之間的序列進行轉錄研究，通過螢光素酶報告基因實驗對轉錄因子Sp1與Sp3對β-catenin啟動子的轉錄調控作用進行了初步的探討。

Sp1或Sp3單獨轉染時，Sp3對β-catenin基因啟動子(-410/-1 bp)的轉錄活性有明顯的增強作用，而Sp1對β-catenin基因啟動子(-410/-1 bp)的轉錄活性的增強作用較弱，說明在β-catenin基因的表達過程中，Sp3主要起著促進轉錄的作用。Sp3作為特殊轉錄因子在β-catenin基因啟動子(-410/-1 bp)區域，與預測結合位點結合，調控轉錄過程，從而解釋前期實驗結果。在HCC組織、細胞、裸鼠成瘤中Sp3均對β-catenin的表達起促進作用，可能是在轉錄水平調控β-catenin的表達。

Figure 4. Effect of transfection of Sp1 and Sp3 on transcription activity of β-catenin promoter (-410/-1 bp). A: transfection of 0.3 μg Sp1 and 0.1 μg Sp3; B: transfection of 0.2 μg Sp1 and 0.2 μg Sp3; C: transfection of 0.1 μg Sp1 and 0.3 μg Sp3.Mean±SD.n=3.

通過不同濃度的Sp1和Sp3共轉染，進一步研究Sp1與Sp3之間的相互作用以及對β-catenin基因啟動子活性的影響。發現隨著Sp3濃度升高，Sp1濃度降低，即Sp3/Sp1比例的遞增，β-catenin基因啟動子(-410/-1 bp)的轉錄活性無明顯變化，說明Sp3與Sp1表達比例的變化并未明顯影響靶基因的轉錄活性。同時，隨著Sp1和Sp3以不同濃度共轉染，與Sp1或Sp3單獨轉染相比，共轉染后該啟動子活性增強，說明Sp1與Sp3共同存在時對轉錄起促進作用，兩者可能存在協同作用。

Sp作為特殊轉錄因子含有高度保守的DNA結合區域，在羧基端有3個串聯的Cys2His2型鋅指結構域，能與GC(GGGGCGGGG)/GT(GGTGTGG)盒及基本的轉錄元件結合。Sp1、Sp3和Sp4結構比較相似，均含有2個谷氨酸轉錄激活區(TADs)，三者能識別并以相似的親和力結合經典的Sp1結合位點[7-8]。其中，Sp1與Sp3蛋白的DNA結合區序列有90%以上的同源性，Sp1和Sp3的結合序列GC/GT盒常以多拷貝形式分布于基因的啟動子或增強子中，Sp1和Sp3以相似的親和力結合這些基因調控區的GC/GT盒，并且與核內其它因子相互作用，發揮對基因轉錄的增強或抑制作用[9-10]。

與本研究結果不同的是，在大多數報道中，Sp3表現出轉錄抑制作用，Sp1與Sp3的相對表達水平影響基因的轉錄：Sp3與Sp1比例的下降能增強啟動子轉錄活性，比例升高則抑制啟動子轉錄活性。如Wong等[11]在結腸癌Caco-2細胞進行螢光素酶報告基因檢測發現，Sp1增強MAOB基因的啟動子轉錄活性，Sp3輕微抑制其活性，共轉染Sp1和Sp3后，下調Sp3/Sp1的比例則提高了MAOB基因的啟動子轉錄活性。Schwarzmayr等[12]在骨肉瘤U2-OS細胞進行螢光素酶報告基因檢測發現，Sp1能顯著增強EAPP基因啟動子活性，Sp3則表現出抑制作用，上調Sp3/Sp1的比例則抑制EAPP基因啟動子活性。吳軍峰等[13]亦有相似報道。

在不同研究中Sp3表現出不同的轉錄活性，我們認為可能與以下因素有關：(1)不同的Sp3蛋白亞型，主導的功能不同：較短的Sp3亞型發揮抑制作用，而全長的Sp3亞型則發揮激活作用[14]；(2)識別位點的結構和排布影響Sp3的調控作用：當啟動子包含1個結合位點時Sp3可能作為激活因子，如果啟動子包含多個結合位點時Sp3則發揮抑制作用[15]；(3)Sp1和Sp3的相對表達水平影響Sp3對靶基因的表達調控，當Sp1存在時Sp3表現出抑制作用[16]；(4)其它蛋白質因子對Sp3活性的影響，如其它蛋白質因子與Sp3的結合能影響其調控轉錄[9]；(5)翻譯后修飾對Sp3轉錄調節活性的影響，如Sp3的乙酰化、蘇素化等[17]；(6)染色質的修飾和結構對Sp3轉錄調節活性的影響[18]等。

目前關于β-catenin表達調控的機制，β-catenin順式作用元件和相關的反式作用因子的報道甚少，本課題組率先對β-catenin啟動子區域的Sp結合位點進行了轉錄調控研究。Nollet等[19]通過基因擴增測序，提出β-catenin基因啟動子區包括轉錄因子NF-κB、Sp1、AP2和EGR1的結合位點。張菊等[20]采用PCR方法首次克隆CTNNB1基因5’上游1.8 kb(-1 650/+150)啟動子，并預測該區域富含GC盒以及多種轉錄因子結合元件如：NKX HP/N KX31、P53F、PERO、RREB和E2FF等。本研究通過螢光素酶報告基因實驗發現，對于β-catenin基因啟動子(-410/-1 bp)，轉錄因子Sp3起著轉錄激活的作用，Sp1則表現出較弱的轉錄激活作用，Sp3/Sp1比例的遞增對β-catenin基因啟動子轉錄活性無明顯影響，Sp1、Sp3共同作用則能促進轉錄。由此我們推測，Sp3作為轉錄因子可能直接或間接調控β-catenin的正向表達，造成β-catenin蛋白在細胞內積聚、核轉位，進而過度激活Wnt/β-catenin信號通路中的下游靶基因，促進細胞增殖、遷移侵襲等。

綜上所述，Sp3可能通過β-catenin影響Wnt/β-catenin信號通路，進而參與HCC的發生發展。而雙螢光素酶報告基因實驗的結果尚不能確定在HCC細胞內Sp3直接與β-catenin啟動子區域結合，仍需更深入的研究去探索體內細胞是否存在此調控關系。

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