NOD8對H2O2誘導的人肝細胞凋亡的影響*

鄭媛媛， 楊文欣， 周 晗， 胡巢鳳

(暨南大學醫學院病理生理學系，國家中醫藥管理局病理生理實驗室，廣東 廣州 510632)

細胞凋亡是一系列信號分子精密調控的程序性死亡過程，由特定基因控制的細胞自主、有序的死亡。研究證實，氧化應激通過影響相關酶類的功能，破壞細胞膜完整性，干擾細胞的穩態，從而引起細胞的凋亡，甚至壞死。H2O2作為一種氧化劑，干擾細胞信號轉導，誘導細胞凋亡[1]。

近年研究發現NOD樣受體(NOD-like receptors, NLRs)為胞漿內的模式識別受體，目前在人類已發現20多個NLRs家族成員，主要含有3個結構域，分別為一個C末端富含亮氨酸的重復序列、位于中央的核苷酸結合位點和N末端的效應結構域。而NOD8 (也稱為PYNOD) 與之不同的是C末端缺乏作為配體識別區域的富含亮氨酸的重復序列，N末端為PYD結構域以及位于中央的核苷酸結合位點[2-5]。Imamura等[6]研究發現NOD8可抑制凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)介導的NF-κB的活化和細胞凋亡，但其抗凋亡機制尚不清楚。Caspase-3作為凋亡效應蛋白在凋亡信號轉導通路中具有重要作用。為進一步探討NOD8在細胞凋亡中的作用, 本研究主要觀察NOD8對H2O2誘導人肝細胞L02凋亡的影響及可能機制。

材 料 和 方 法

1 細胞、質粒與主要試劑

人肝細胞L02由中山大學惠贈；pEGFP-C2為本室保存；pEGFP-NOD8真核表達質粒由本課題組構建。

DMEM細胞培養基、PBS、含0.25% EDTA的胰酶為Gibco產品；胎牛血清購自BI；細胞轉染所用的陽離子聚合物JetPRIME為Polyplus產品； Annexin V-PE/7-AAD和caspase-3活性檢測試劑盒購自Biovision；BCA蛋白定量試劑盒為上海申能博彩生物公司產品；NOD8多克隆抗體購自Santa Cruz；HRP標記的兔Ⅱ抗購自CST；Hoechst 33342、硝酸纖維素膜(Millipore)、濾紙、考馬斯藍R-250、Tween-20、牛血清白蛋白、脫脂奶粉和SDA-PAGE試劑盒均購自碧云天公司；其它生化試劑均為分析純產品。

2 主要實驗方法

2.1MTT法檢測不同濃度H2O2對細胞活性的影響 將L02細胞以1×104cells/well 鋪于96孔板，每組設6個復孔，并設與實驗平行的本底對照孔，分別加入0.2、 0.4、 0.6、0.8、1和2 mmol/L 濃度的H2O2。6 h后每孔加入20 μL質量濃度為5 g/L的MTT溶液，置于37 ℃、5%CO2培養箱繼續孵育4 h后，棄孔內液體，每孔加入150 μL DMSO振蕩10 min，待藍色顆粒完全溶解后，酶標儀 (Thermo Scientific) 檢測波長為570 nm的吸光度值(Avalue)。

2.2L02細胞培養及重組質粒轉染細胞 采用10%胎牛血清的DMEM高糖培養液培養，并加入1×105U/L 青霉素和 100 mg/L 鏈霉素，在37 ℃、5% CO2條件下進行細胞培養及傳代。L02細胞按1×108/L分別接種于24孔板內，待細胞生長至75%融合時進行轉染，分為3組：pEGFP-C2組(pEGFP-C2空質粒轉染細胞)；pEGFP-C2+H2O2組(pEGFP-C2轉染細胞24 h后，加1 mmol/L H2O2繼續培養6 h)；pEGFP-NOD8+H2O2組(pEGFP-NOD8轉染細胞24 h后，加1 mmol/L H2O2繼續培養6 h)。將JetPRIME/DNA復合物加入培養板，上下輕搖混勻，然后放置于37 ℃、5 % CO2培養箱培養。24 h后相應組加1 mmol/L H2O2繼續培養6 h。

2.3Western blotting檢測NOD8蛋白表達 收集(1～5)×106L02細胞，用預冷的PBS洗滌3次，加60 μL的細胞裂解液，冰上孵育30 min，離心15 min，收集上清。Bradford法檢測蛋白濃度，加入5×loading buffer 加熱變性，用SDS凝膠電泳，5% 濃縮膠、10%分離膠分離蛋白后，將蛋白通過電轉移方式轉移至硝酸纖維薄膜上，用特異性抗體檢測NOD8蛋白表達，以GAPDH作為標準蛋白內參照。

2.4Hoechst 33342染色法檢測細胞凋亡 細胞接種于24孔板內，細胞培養24 h, 棄上清，用PBS洗滌細胞2次，用4%的多聚甲醛固定30 min之后，用PBS洗滌2次，吸盡液體，加入0.5 mL Hoechst 33342染色液，染色15 min后于熒光顯微鏡下觀察。激發波長為350 nm，發射波長為460 nm左右。

2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 收集細胞在(1～5)×106個以內。PBS洗滌細胞2次，加200 μL 1× binding buffer重懸細胞，用Annexin V-PE/7-AAD染色后流式細胞儀檢測。加5 μL Annexin V-PE ，室溫孵育15 min；再用1×binding buffer洗滌細胞2次，200 μL 1×binging buffer重懸細胞，加5 μL 7-AAD viability staining solution，4 h內用流式細胞儀分析。

2.6比色法測定caspase-3活性 按照2.2法分組，L02肝細胞培養6 h后，消化、離心、收集各組細胞。用50 μL的細胞裂解液重懸細胞，冰上孵育10 min, 再加入96孔板中, 每孔依次加入含10 mmol/L DTT的2×reaction buffer 50 μL，及1 mmol/L YVAD-AFC substrate 5 μL，隨后放置于37 ℃溫箱孵育1～2 h，酶標儀400 nm激發波長，505 nm發射波長下測定各孔的A值。計算每一種樣品蛋白含量標準化校正后的A值；將該值與對照組(pEGFP-C2組)A值相比，計算出各組細胞樣品中caspase-3的相對活性。

3 統計學處理

所有實驗數據使用SPSS 13.0 統計軟件進行分析和處理。計數資料數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，各組方差齊時，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)；各組方差不齊時，兩兩比較采用Tamhane’s T2法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同濃度H2O2對細胞活性的影響

采取MTT法分析不同濃度的H2O2對L02細胞細胞活性的影響。與對照組相比較，0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/L H2O2對細胞活性無明顯影響，(P>0.05)；1～2 mmol/L H2O2可使細胞活力明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。因此，選擇1 mmol/L H2O2作為誘導細胞凋亡的濃度(圖1)。

Figure 1. The effect of H2O2 on activity of L02 cells. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs control.

2 重組質粒轉染人L02肝細胞后綠色熒光蛋白的表達情況

pEGFP-C2和pEGFP-NOD8質粒帶有綠色熒光蛋白基因，質粒轉染入細胞后，在倒置熒光顯微鏡下可觀察到細胞內綠色熒光，高倍鏡下計數轉染率約40%。Western bloting 檢測結果顯示，轉染pEGFP-C2 空質粒細胞有少量NOD8 蛋白表達，而轉染pEGFP-NOD8細胞NOD8 蛋白表達明顯增加，見圖2。

3 Hoechst 33342染色觀察細胞的凋亡情況

Hoechst 33342染色后，在倒置熒光顯微鏡下觀察L02細胞凋亡情況，pEGFP-C2組僅有少量細胞出現細胞核強藍色熒光現象；pEGFP-C2+H2O2組較多細胞出現強藍色熒光細胞核，染色質高度凝聚或呈碎塊狀，細胞凋亡增加；而pEGFP-NOD8+ H2O2組上述現象明顯減少，說明NOD8抑制細胞凋亡，見圖3。

4 流式細胞術檢測L02細胞的凋亡率

Annexin V-PE/7-AAD染色后，用流式細胞儀檢測分析L02細胞凋亡率，結果顯示，與pEGFP-C2組比較，pEGFP-C2+H2O2組細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)；而與pEGFP-C2+H2O2組相比，pEGFP-NOD8+ H2O2組細胞凋亡率顯著下降(P<0.05)，見圖4。

5 過表達NOD8抑制H2O2誘導的L02細胞caspase-3活性

如圖5所示，與pEGFP-C2組比較，pEGFP-C2+H2O2組caspase-3活性明顯升高(P<0.01)；而與pEGFP-C2+H2O2組相比，pEGFP-NOD8+ H2O2組caspase-3活性顯著下降(P<0.05)。

Figure 2. The protein expression of EGFP and NOD8 after the plasmids transfected into L02 cells for 24 h. A: pEGFP-C2 (×200); B: pEGFP-NOD8 (×200); C: pEGFP-C2 (×400); D: pEGFP-NOD8 (×400); E: the protein expression of NOD8 detected by Western blotting.

Figure 3. The effect of NOD8 on the apoptosis of L02 cells induced by H2O2 (Hoechst 33342 staining，×400).

Figure 4. The effect of NOD8 on the apoptotic rate in L02 cells induced by H2O2. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs pEGFP-C2; ## P<0.01 vs pEGFP-NOD8+H2O2.

Figure 5. The effect of NOD8 on the caspase-3 activity in L02 cells induced by H2O2 . Mean±SD. n=4. ## P<0.01 vs pEGFP-C2; *P<0.05 vs pEGFP-NOD8+ H2O2.

討 論

細胞周期作為一個有序進行的過程，當細胞在有序的生命活動過程中出現無法被修復的嚴重DNA損傷、信號通路的紊亂及細胞內環境的失態時，細胞周期被不可逆的阻滯，進而促使細胞凋亡[7]。細胞凋亡是在個體發育生長過程中為維護機體內環境的穩態、調控機體發育、具有基因編碼的細胞死亡過程，是機體對外界刺激進行的主動應答，貫穿于機體的整個生命過程中[8]。由于內源性和(或)外源性刺激使機體代謝異常而產生的活性氧增多, 常使機體處于氧化應激狀態，導致細胞凋亡。而細胞凋亡功能亢進與組織損傷和器官功能衰竭的發病密切相關[9-10]。

NLRs在天然免疫反應中發揮了重要的作用，我們前期研究證實, NOD8可抑制LPS誘導巨噬細胞釋放炎癥因子[11]。國外有研究發現, 將ASC轉染HEK293T-Y細胞可導致細胞凋亡；但同時轉染ASC及NOD8則HEK293T-Y細胞凋亡明顯減少，NOD8可以抑制ASC介導的細胞凋亡[5], 但其抗凋亡機制尚不清楚。本研究用H2O2損傷L02 細胞作為誘導肝細胞凋亡的模型, 進一步探討NOD8在細胞凋亡中的作用及可能機制。本實驗用MTT法檢測細胞活性，確定1 mmol/L H2O2為誘導細胞凋亡的劑量。選擇轉染效果高、細胞毒性小的轉染試劑陽離子聚合物瞬時轉染質粒，結果發現，重組質粒pEGFP-NOD8轉染細胞后綠色熒光蛋白及NOD8蛋白表達明顯增加，證實質粒瞬時轉染成功。Hoechst 33342染色顯示，H2O2誘導的細胞多數發生了細胞核呈強藍色，染色質高度凝聚、濃縮邊緣化或碎塊，說明細胞凋亡增多；而轉染重組質粒pEGFP-NOD8后上述現象明顯改善，結果證明NOD8能抑制細胞凋亡。進一步用流式細胞術檢測細胞凋亡率，結果發現，與pEGFP-C2組比較，pEGFP-NOD8組細胞凋亡率明顯增加；而重組質粒pEGFP-NOD8轉染細胞后能顯著抑制由H2O2誘導的細胞凋亡，說明NOD8在細胞凋亡方面發揮負性調節作用。另外，caspases家族是一組存在于胞質溶膠中結構上相關的半胱氨酸蛋白酶，都含有半胱氨酸活性位點，并特異斷開天冬氨酸殘基后的肽鍵。Caspase-3是caspases家族成員之一，具有相近的底物和抑制劑特異性，可導致DNA修復的抑制并啟動DNA的降解，從而導致核纖層和細胞骨架的崩解，促使細胞凋亡；caspase-3被認為是細胞凋亡執行階段的關鍵蛋白酶[12]。本研究結果發現，H2O2可明顯增加caspase-3活性，NOD8則顯著抑制caspase-3活性。本研究從定性和定量方面說明NOD8對細胞凋亡具有抑制功效。

綜上所述，NOD8能夠抑制由H2O2誘導L02細胞的凋亡，其作用機制可能是通過抑制caspase-3活化。隨著對NOD8抗凋亡作用的深入研究，將為臨床治療多種肝臟疾病及神經元退行性疾病提供新的思路。

[參 考 文 獻]

[1] Xu Q, Ma P, Yu W, et al. Chitooligosaccharides protect human embryonic hepatocytes against oxidative stress induced by hydrogen peroxide[J]. Mar Biotechnol, 2010, 12(3):292-298.

[2] Inohara N, Chamaillard M, Mcdonald C, et al. NOD-LRR proteins: role in host-microbial interactions and inflammatory disease[J]. Annu Rev Biochem, 2005, 74:355-383.

[3] Fritz JH, Ferrero RL, Philpott DJ, et al. Nod-like proteins in immunity, inflammation and disease[J]. Nat Immunol, 2006, 7(12):1250-1257.

[4] Kanneganti TD, Lamkanfi M, Nunez G. Intracellular NOD-like receptors in host defense and disease[J]. Immunity, 2007, 27(4):549-559.

[5] Wang Y, Hasegawa M, Imamura R, et al. PYNOD, a novel Apaf-1/CED4-like protein is an inhibitor of ASC and caspase-1[J]. Int Immunol, 2004, 16(6):777-786.

[6] Imamura R, Wang Y, Kinoshita T, et al. Anti-inflammatory activity of PYNOD and its mechanism in humans and mice[J]. J Immunol, 2010, 184(10):5874-5884.

[7] Malumbres M, Barbacid M. Cell cycle kinases in cancer[J]. Curr Opin Genet Dev, 2007, 17(1):60-65.

[8] 高紹瑩，羅軍敏，秦 歡. Toll樣受體信號介導細胞凋亡的研究進展[J].細胞與分子免疫學雜志, 2014,30(4):440-443.

[9] Coyle JT, Puttfarcken P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders[J].Science,1993, 262(5134): 689-695.

[10]Ding X, Wang MY, Yao YX, et al. Protective effect of 5-hydroxymethylfurfural derived from processedFructusCornion human hepatocyte LO2 injured by hydrogen peroxide and its mechanism[J]. J Ethnopharmacol ,2010,128(2): 373-376.

[11]田 莉，鄭媛媛，胡巢鳳，等. NOD8對LPS誘導巨噬細胞釋放NO、TNF-α和IL-1β的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(5):889-894.

[12]趙瑞杰，李引乾，王 會，等. Caspase家族與細胞凋亡的關系[J]. 中國畜牧雜志， 2010, 46(17):73-78.