血清水通道蛋白4抗體測定對視神經脊髓炎的診斷及預后判斷價值*

厲 向， 童巧文， 柯建明， 葉莉萍， 戚飛騰， 萬 真， 夏君慧△

(溫州醫科大學 1附屬第一醫院神經內科，2第三臨床學院神經內科，浙江 溫州 325000；3煙臺市毓璜頂醫院重癥監護室,山東 煙臺 264000)

視神經脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是一種特發性炎性脫髓鞘疾病，病變主要侵犯視神經和脊髓，導致嚴重的視神經炎和橫貫性脊髓炎[1]。與多發性硬化(mutiple screlosis，MS)在臨床上較難鑒別。常規治療MS的β干擾素反而加重NMO及其疾病譜系患者的病情[2]，故盡早進行鑒別診斷尤為重要。Lennon等[3]在NMO患者血清中檢測出特異性自身抗體NMO-IgG，并且證實其靶抗原為水通道蛋白4 (aquaporin 4, AQP4)， 有力地支持了NMO是有別于MS的自身抗體免疫性水通道病，此后越來越多的證據表明AQP4抗體參與到NMO的病理過程[4-5]。本研究以穩定表達人增強型綠色熒光蛋白-AQP4 (EGFP-AQP4)的人胚腎上皮細胞(human embryonic kidney epithelial 293, HEK293)為底物，建立檢測血清AQP4抗體的CBA法，旨在討論血清AQP4抗體檢測對NMO患者的診斷、鑒別診斷及預后判斷的價值，并探討開展臨床應用的可行性。

材 料 和 方 法

1 對象

回顧調查2010年1月至2013年12月在溫州醫科大學附屬第一醫院神經內科住院或門診就診并隨訪的206例患者，包括48例NMO、33例脊髓炎(transverse myelitis, TM)[包括26例長節段脊髓炎(脊髓MRI提示病灶大于3個脊髓節段)(longitudinally extensive transverse myelitis, LETM)和7例復發性脊髓炎(relapse longitudinally extensive transverse myelitis, rLETM)]、30例視神經炎(optic neuritis, ON)[其中包括25例雙眼視神經炎(simultaneous bilateral optic neuritis, BON)和5例復發性視神經炎 (recurrent isolated optic neuritis, RION)]、52例MS及16例其它神經系統疾病(other neurological disease, OND)。OND包括7例腦梗死、2例帕金森病、3例頭痛和6例腦出血患者。經醫院倫理委員會審核，所有患者均由兩位資深的神經內科醫師確定診斷。入選標準：NMO組患者及其譜系疾病患者均采用Wingerchuk等[6]2006年修改版診斷標準(除血清AQP4抗體陽性外)。MS組患者均符合2010年McDonald診斷標準[7]。所有患者近期未進行免疫抑制劑或者激素治療。

2 方法

2.1臨床資料收集 通過對患者進行病史回顧及隨訪獲得的臨床資料分析包括性別、起病年齡、臨床表現、病程、首發索引事件、診斷為NMO的時間、年復發率、嚴重視神經炎[功能評分 (function score，FS)>5分]和最近1次EDSS評分。輔助檢查：包括腦脊液、視覺誘發電位(visual evoked potential，VEP)檢查、抗核抗體(antiunuolear antibodies，ANA)自身抗體檢測、頭顱和脊髓MRI檢查。清晨空腹采集所有患者靜脈血，離心留取血清，保存于-80 ℃冰箱備用。

2.2細胞株構建及基因轉染 參照Lennon等[3]文獻中的AQP4轉染HEK293細胞株方法。應用總RNA提取試劑盒提取成人腦組織總RNA行RT-PCR，以特異性引物擴增AQP4基因。上游引物：5’-CGCAGATCTGCCACCATGAGTGACAGACCCACAGC-3’，內含BglII酶切位點；下游引物：5’- CCGGTACCGGTACTGAAGACAATACCTC-3’，內含KpnⅠ酶切位點。將擴增產物克隆到pEGFP-N1(由溫州醫科大學附屬第一醫院醫科所蔣磊博士惠贈)上，構建pEGFP-N1-AQP4重組質粒，雙酶切和基因測序、基因比對鑒定。接種HEK293細胞(購自中科院上海細胞庫)，24 h后細胞融合達90%，采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染。將pEGFP-N1+AQP4轉染HEK293細胞。采用G418篩選穩定表達AQP4的細胞株。

2.3血清AQP4抗體檢測 將穩定轉染生長狀態良好的重組質粒的HEK293細胞消化后鋪板培養過夜，融合達50%左右。PBS漂洗后，予4%多聚甲醛室溫下固定細胞30分鐘。后加入5%驢血清室溫封閉1 h。使用5%驢血清稀釋待測血清，稀釋比例分別為1∶20、1∶200、1∶600、1∶1 800和1∶3 600，與細胞共孵育，濕盒中4 ℃過夜。PBS漂洗后加入1∶400稀釋的熒光標記驢抗人IgG(Abcam)，室溫避光孵育2 h。PBS漂洗后加DAPI(Sigma)染細胞核。置于熒光顯微鏡(Leica)下觀察細胞株，如圖1。結合以往研究[8-9]，我們選定稀釋濃度大于20倍時顯示陽性的結果認為AQP4檢測陽性，設定最小滴度為20倍。

Figure 1. Detection of specific AQP4 expression at the HEK293-AQP4/EGFP cells (×100). AQP4-expressing cells were incubated with detected serum and donkey antiserum specific for IgG. The colocalization of the surface-expressed AQP4(green) and the anti-IgG antibody(red) indicates that the antibodies are against AQP4. The merge shows that AQP4 was expressing on the surface of cell.

3 統計學處理

統計數據均采用SPSS 21.0軟件包進行分析。非正態分布計量資料和計數資料用中位數(最小值，最大值)表示, 2個獨立樣本比較采用秩和檢驗。2個樣本率的比較用Pearson2檢驗， 若T<5時，采用Fisher確切概率法。評價抗AQP4抗體對NMO的診斷價值，做受試者工作特征曲線(receive operating characteristic curve，ROC)進行比較。繪制Kaplan-Meier曲線分析血清AQP4抗體陽性患者進展為NMO的累計概率。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組AQP4抗體陽性率及滴度比較

患者的分組及各組AQP4抗體陽性率、抗體滴度見表1、圖2。NMO組、TM組、ON組陽性率明顯高于MS組(P<0.05)。其中rLETM組、RION組陽性率與NMO組比較，差異無統計學意義。LETM組陽性率亦高于MS組(P<0.05)。而BOD組陽性率與MS組無顯著差異。OND組均為陰性。AQP4抗體滴度較高的患者基本集中于NMO組，其滴度分布與各組相比均具有顯著差異(P<0.05)。

2 AQP4抗體診斷NMO的ROC曲線分析

以Wingerchuk等[6]2006年修改版診斷標準(除血清AQP4抗體陽性)為金標準，繪制評價血清AQP4抗體對NMO診斷的特異性和敏感性的ROC曲線分析，見圖3。AQP4抗體曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.91，有統計學意義(P<0.05)。AQP4抗體滴度以大于20倍為陽性，其敏感性為87.5%，特異性為85.4%。

表1 各組別血清AQP4抗體滴度及陽性率比較

Figure 2. AQP4 antibody titers according to clinical phenotype.

Figure 3. ROC curve of serum AQP4 antibody for diagnosing NMO.

3 NMO組AQP4陽性患者及陰性患者臨床特征比較

NMO組AQP4陽性組及陰性組的臨床資料如表2所示。NMO組患者共48例，其中AQP4陽性患者為42例，陰性患者為6例。通過對臨床特征進行比較，可見AQP4陽性患者中男性6例，女性36例，構成比約1∶6；陰性患者中男性3例，女性3例，構成比為1∶1，差異有統計學意義(P<0.05)。NMO組AQP4陽性患者發病年齡為16～63歲，中位數發病年齡為37.5歲，陰性患者發病年齡為14～32歲，中位數發病年齡為31.5歲，差異有統計學意義(P<0.05)。NMO組AQP4陽性患者確診為NMO時間為0～96個月，中位數時間為12個月，陰性組確診為NMO時間為1～102個月，中位數時間為28個月，差異有統計學意義(P<0.05)。NMO組AQP4陽性患者中嚴重視神經炎者(FS>5分)有13例，陰性組有2例，2組差異具有統計學意義(P<0.05)。而就年復發率、首發索引事件、腦脊液(cerebros-pinal fluid，CSF)表現、ANA抗體陽性率、EDSS評分及脊髓病變大于3個椎體節段的比例而言，NMO組AQP4陽性患者與陰性患者比較均無明顯差異(P>0.05)。AQP4抗體陽性NMO患者有83.3%(35/42)在初次發病24個月后被確診為NMO。而AQP4陰性NMO患者僅33.3%(2/6)在初次發病24個月后被確診為NMO(P<0.05)。

表2 NMO組血清AQP4抗體陽性患者及陰性患者臨床特征比較

4 AQP4抗體與發展為NMO的關系

應用Kaplan-Meier曲線分析188例血清AQP4抗體陽性和陰性的NMO、ON、TM和MS患者從首次發作進展為NMO的累積概率生存函數，見圖4。該曲線顯示AQP4抗體陽性組曲線明顯低于抗體陰性組，提示AQP4抗體陽性患者進展為NMO的累積概率明顯高于抗體陰性的患者(P<0.05)。

Figure 4. The Kaplan-Meier curve for the accumulated survival rate of AQP4 antibody for the progress to NMO

討 論

NMO與MS臨床癥狀有相似，盡管腦脊液寡克隆帶、影像學有所不同，但因為缺乏較為特異性的生物學標志，鑒別診斷仍有困難。NMO-IgG及特異性靶抗原AQP4的發現，標志著NMO作為一種新的中樞神經系統自身免疫系統性疾病而獨立于MS。AQP4抗體被認為通過以下途徑參與病理過程：(1)參與血腦屏障的破壞；(2)啟動炎癥免疫反應，激活補體和細胞因子，導致血管周圍的炎癥細胞浸潤；(3)介導星形膠質細胞損傷及脫髓鞘作用[10]。隨著AQP4抗體的發現與檢測，一些發病機制與NMO類似的非特異性炎性脫髓鞘疾病(如LETM、rLETM、RION等)的AQP4抗體陽性率也較高。2006年Wingerchuk等[6]將血清NMO-IgG納入NMO的診斷標準，并提出了視神經脊髓炎譜系疾病(NMO spectrum disorders, NMOSD)這一概念。

隨著AQP4抗體參與NMO的發病機制研究成為熱點，關于NMO血清中AQP4抗體檢測的實驗大量開展。國內外學者通過比較各種檢測血清AQP4抗體的方法[11-12]，發現CBA法的敏感性為最高(72.4%～91%)，且保持100%的特異性，明顯優于間接免疫熒光法、ELISA法等。該方法最初由Lennon等[3]在2005年采用，具有以下優點：(1)CBA法采用人AQP4轉染至胚腎細胞系HEK293中，避免種屬的差異，明顯優于傳統應用冰凍鼠小腦或腦干切片上測定抗體的IIF法；(2)CBA法表達全肽段的自然折疊的人類AQP4抗原，從而避免了在氨基酸序列上及結構的差異影響，與人AQP4抗體特異性結合，而傳統的ELISA法應用人工合成的AQP4蛋白或者多肽，導致蛋白空間結構異常而無法特異性結合AQP4抗體[13]。本實驗應用CBA法是通過穩定表達AQP4的HEK293作為底物，來檢測血清AQP4抗體。本實驗通過ROC曲線評價AQP4抗體水平的診斷效益顯示AQP4抗體對診斷NMO的敏感性為87.5%，特異性為85.4%，AUC達到0.91。AQP4抗體陽性率與國內及其它亞洲國家研究結果相似(73%～91%)[14-15]，提示血清AQP4抗體水平對診斷NMO具有較高的診斷效益。各組陽性率比較顯示NMO組、rLETM組、RION組陽性率明顯高于其它組，均在80%左右。Chan等[11]同樣應用CBA法測定血清AQP4抗體，發現rLETM(75%)和RION(33%)的陽性率均高于單次發病的TM(4%)和ON(14%)。結合80%～90%NMO患者由rLETM和RION發展而來[1， 6]，來看這兩類NMOSDs血清AQP4抗體陽性發病形式的患者有較大可能轉化為NMO。而MS組存在2例患者血清AQP4抗體陽性，1例患者為進展型MS，另1例曾有視神經受累。故需進一步隨訪是否轉歸為NMO。

本實驗在調查隨訪的浙南地區視神經脊髓炎患者中，比較了AQP抗體陽性與陰性患者的臨床特征。NMO組陽性患者(1∶6)較陰性患者(1∶1)更傾向于女性，結果符合之前NMO研究的性別特征[16]。NMO組AQP4抗體陰性患者中位數發病年齡(31歲)較AQP4抗體陽性(37.5歲)患者年輕，這與既往國內外結果一致[15, 17]。類似研究[13, 16]發現AQP4抗體陽性患者更傾向于出現嚴重視神經炎(FS>5，即壞眼矯正視力小于0.1)。本實驗NMO組AQP4抗體陽性患者(13/36)存在嚴重視神經炎的比例高于AQP4抗體陰性患者(P<0.05)，提示血清AQP4抗體與病情程度可能相關。同時我們發現NMO組AQP4抗體陽性患者確診為NMO的中位數時間(12個月)較陰性患者(28個月)明顯縮短，且2年內診斷為NMO的血清AQP4陽性患者明顯多于血清AQP4陰性患者。而Jarius等[17]針對高加索人種的多中心臨床研究發現AQP4抗體陰性患者確診為NMO所需時間較陽性組短，考慮本實驗與該實驗結果不同的原因可能是人種及地域、起病形式的不同及樣本量大小有關，需今后加大樣本量后回顧研究。而年復發率、首發索引事件、腦脊液結果、ANA抗體、EDSS評分和病變累及大于3個脊髓節段等指標，NMO組AQP4陽性患者與陰性患者比較，均無明顯差異。

我們回顧調查并隨訪188例NMO、ON、TM和MS等非特異性炎性脫髓鞘疾病患者，記錄其首次發作時間及臨床表現，并檢測其血清AQP4抗體，應用Kaplan-Meier曲線分析AQP4抗體陽性和陰性的患者從首次發作進展為NMO的累積概率生存函數。曲線提示AQP4抗體陽性患者進展為NMO的累積概率明顯高于抗體陰性的患者，并且AQP4陽性患者進展為NMO的速度更快。故若首發出現ON或者LETM的患者同時合并血清AQP4抗體陽性，提示具有短期內進展為NMO的高危風險，應進行長期隨訪證實，及時進行免疫調節或免疫抑制治療。

綜上所述，本實驗所采用細胞免疫熒光法檢測AQP4抗體可行有效，對于診斷NMO有較高敏感性和特異性。AQP4抗體陽性NMO患者更易出現嚴重視力損害，AQP4抗體陽性患者更快進展為NMO。可以提倡AQP4抗體檢測作為鑒別NMO和其它脫髓鞘疾病的臨床生物指標，有助于對NMO的早期診斷和轉歸預后預測。

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