PYNOD對LPS活化的BV2小膠質細胞炎癥因子釋放的影響*

曾 琪， 戚仁斌， 胡巢鳳， 陸大祥△

(1贛南醫學院第一附屬醫院，江西 贛州 341000； 2暨南大學醫學院病理生理學系，廣東 廣州 510632)

小膠質細胞廣泛分布在大腦和脊髓中。中樞神經系統變性疾病過程中的免疫異常主要表現為小膠質細胞過度活化，特定腦區炎癥因子水平升高[1]。在許多神經系統變性疾病中，如帕金森病(Parkinson disease, PD)、阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)及多發性硬化癥(multiple sclerosis, MS)等，都出現了小膠質細胞的過度活化和增殖，這是中樞神經系統疾病炎癥反應的一個重要表現。

文獻報道，小膠質細胞過度活化不斷釋放一氧化氮(nitric oxide, NO)、誘導型一氧化氮合酶(inducible NO synthase, iNOS)、白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、caspase-1以及其它促炎因子是導致神經元細胞死亡的原因[2-4]。這些炎癥因子對神經元可以產生強烈的毒性作用，最終導致神經元變性壞死。因此抑制小膠質細胞的過度活化是目前防治神經退行性疾病的一個重要策略。

近年來，Wang等[5]發現一種新型的在體外具有抗炎活性的NOD樣受體(NOD-like receptors,NLRs)家族成員PYNOD。它由PYD結構域和NOD結構域組成，與該家族的其它成員不同，PYNOD的C末端缺乏作為配體識別區域的富含亮氨酸的重復序列(leucine-rich repeats，LRRs)，也稱NOD8[6-7]、 NLRP10、NALP10、CLR11.1或PAN5[5，8]。通過對PYNOD和炎癥相關因子構建重組質粒，研究其相互間的作用發現，PYNOD有抑制由caspase-1介導的IL-1β分泌的作用，這是NLRs家族中首個被發現的對炎癥起負調節作用的成員。但PYNOD在神經炎癥中所發揮的作用尚不清楚。本研究觀察PYNOD在LPS激活的BV2小膠質細胞中的抗炎作用。

材 料 和 方 法

1 材料

BV2細胞和質粒pEGFP-C2由本室保存；pEGFP-C2-PYNOD重組質粒由本實驗室前期構建；大腸桿菌E.coliDH5α購自北京天根生化科技有限公司；細胞轉染所用的陽離子聚合物JetPeiTM為Polyplus產品；細胞培養基DMEM和胎牛血清為Gibco產品；胰蛋白酶購自Hyclone；逆轉錄試劑盒購自TaKaRa；二甲基亞砜(DMSO)和LPS為Sigma產品；中分子蛋白Marker為Fermentas產品；Griess試劑盒購自Promega；所有抗體均購自CST；小鼠IL-1β ELISA試劑盒購自R&D；BCA法蛋白定量試劑盒購自上海申能博彩公司；硝酸纖維素膜為Millipore產品。

2 實驗方法

2.1MTT法檢測細胞活力 將BV2細胞以1×104/well 鋪于96孔板，每組設4個復孔，并設與實驗平行的本底對照孔。細胞長滿78%～80%后轉染PYNOD重組質粒，孵育24 h，每孔加入20 μL質量濃度為5 g/L的MTT溶液，37 ℃、5% CO2培養箱內孵育4 h，棄孔內液體，加入150 μL DMSO振蕩10 min，待藍色顆粒完全溶解后，在全自動酶標儀上檢測570 nm處的吸光度(A)，以此定量反映細胞的活力。細胞活力=(加藥組A值-不加細胞組A值)/(對照組A值-不加細胞組A值)×100%。

2.2分組和給藥 用含10% 的胎牛血清的DMEM高糖培養基培養BV2細胞，0.25%胰酶消化BV2細胞，根據實驗要求，以6×104/well 密度接種在24孔細胞培養板上，實驗分組如下：正常對照組(negtive control)；脂多糖組(LPS, 1 mg/L)； PYNOD低量轉染組：0.1 μg PYNOD轉染24 h后，給予1 mg/L LPS刺激； PYNOD中量轉染組：0.5 μg PYNOD轉染24 h后，給予1 mg/L LPS刺激； PYNOD高量轉染組：1.0 μg PYNOD轉染24 h后，給予1 mg/L LPS刺激。

2.3Griess法測定NO含量 根據NO溶解于水后可以形成亞硝酸鹽的原理，測定培養基中亞硝酸鹽(NO2-)的含量，可以間接反應細胞上清中NO的含量。將BV2細胞以6×104/well 密度接種在24孔細胞培養板上，貼壁過夜后，轉染處理。LPS 刺激24 h 后對NO2-進行濃度的測定。具體操作步驟如下，實驗前將試劑A、 B從4 ℃冰箱中取出，放置在室溫平衡30 min。亞硝酸鹽(nitrite)標準品梯度稀釋(100、50、25、12.5、6.25、3.12和1.56 μmol/L)，用來制作標準曲線。將稀釋的標準品以及待測樣本細胞上清液(均設3個復孔)各50 μL，加入 96孔板中，然后加入A溶液50 μL，室溫避光孵育10 min，再加入B溶液50 μL，室溫避光孵育10 min后，于30 min 內用酶標儀在550 nm波長處測定吸光度。根據標準曲線計算上清液中NO2-含量。

2.4Real-time PCR檢測 iNOS和IL-1βmRNA的表達 參照GenBank上小鼠iNOS和IL-1β基因的公布序列，用引物設計軟件Primer 5.0對其進行引物設計。設計上、下游引物，同時以擴增GAPDH作為內參照，由上海英駿生物公司合成。具體的引物序列見表1。

表1 引物序列

按實驗分組培養細胞，37 ℃、5% CO2中培養24 h。收集細胞提取RNA并鑒定純度；按逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄RNA。Real-time PCR反應體系如下：cDNA 1 μL、2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、引物(10 mol/L)各 0.4 μL，加RNase-Free H2O 至20 μL混勻。反應條件為：95 ℃10 s； 95 ℃30 s，62 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40 個循環；于每個循環的72 ℃ 10 s末收集1次熒光信號，循環結束后執行收集熔解曲線程序。各梯度濃度的相對標準品均設3 個平行管，反應完畢后用熒光定量分析軟件進行自動繪制擴增曲線以及熔解曲線，通過對熔解曲線的分析來檢測產物特異性。建立標準曲線后，可對各受試樣本的相對定量值進行檢測。

2.5Western blotting 檢測iNOS的蛋白水平 按實驗分組培養細胞，37 ℃、5% CO2培養， LPS刺激24 h后提取細胞總蛋白，操作步驟見下：棄培養液，用預冷的PBS 清洗3 次，每孔加 200 μL 細胞裂解液，冰上裂解 30 min，800 r/min，4 ℃離心5 min， 取上清， BCA 法蛋白定量。10% SDS- PAGE 分離蛋白， 半干法轉至 PVDF 膜。室溫下用封閉液封閉 2 h 后分別加入iNOS(1∶1000)和 GAPDH(1∶1000)抗體， 4 ℃孵育過夜。次日用TBST 洗膜3 次，每次10 min。將PVDF膜放于按1∶5000用TBST稀釋的HRP標記的羊抗小鼠II抗，室溫緩慢振蕩1 h 后，TBST 洗膜3 次，每次10 min。 將Western blotting 化學熒光試劑A、B 各300 μL 等量混合后，沖洗PVDF膜5 min后，于暗房中X 光片曝光，掃描儀掃描Western blotting圖像，Gel-pro Analyzer 4.5軟件分析Western blotting條帶的灰度。

2.6ELISA法測定BV2細胞中IL-1β的含量 按上述分組培養細胞，37 ℃、5% CO2培養24 h；取出96孔培養板，4 ℃離心，200×g離心15 min，將每孔上清移至200 μL 滅菌離心管中，置-80 ℃保存備用。試劑盒從冰箱中取出后置室溫下復溫，雙蒸水稀釋濃縮的洗滌液(1∶20)。將標準品成比稀釋為所需的濃度。在使用前的30 min，按1∶100比列將試劑盒中提供的濃縮生物素化抗體和濃縮酶結合物分別稀釋為生物素化抗體工作液和酶結合物工作液，使用前30 min準備。將細胞上清液樣本提前從-80 ℃冰箱中取出放置于4 ℃冰箱中，臨用平衡于室溫。實驗具體步驟參見R&D ELISA試劑盒說明書。計算每一種樣品3個復孔A值的平均值，將該值代入上述由標準品得到的直線回歸方程中，計算出細胞培養上清液中樣品的含量。

3 統計學處理

所有結果以SPSS 11.0軟件處理，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，數據比均采用單因素方差分析, 以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 轉染重組質粒pEGFP-C2-PYNOD對BV2細胞活力的影響

如圖1，結果提示 0.1～1 ng重組質粒pEGFP-C2-PYNOD作用BV2小膠質細胞 24 h 后，不影響小膠質細胞活力，與空白對照組相比較，差異沒有統計學意義(P>0.05)。

Figure 1. The effect of pEGFP-C2-PYNOD on the activity of BV2 cells. Mean±SD. n=3.

2 PYNOD抑制LPS激活的BV2細胞釋放NO

活化的小膠質細胞能釋放NO參與神經炎性損傷，為了分析PYNOD抑制NO釋放的作用，采用Griess試劑間接檢測細胞上清中NO。結果見圖2，單獨轉染pEGFP-C2和pEGFP-C2-PYNOD質粒組有少量NO釋放，單純給予LPS刺激組的細胞釋放的NO量顯著升高，轉染不同量pEGFP-C2-PYNOD 的質粒組中，NO的釋放呈現劑量依賴效應；其中0.5 μg和1.0 μg的pEGFP-C2-PYNOD轉染組NO的釋放量分別降至27 μmol/L和15 μmol/L，差異有統計學意義(P<0.05)。以上結果提示PYNOD對LPS激活的BV2細胞釋放NO有顯著抑制作用。

Figure 2. Inhibitory effect of PYNOD on the release of NO in LPS-stimulated BV2 cells. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs LPS alone.

3 PYNOD下調LPS 誘導小膠質細胞iNOS的 mRNA 表達

由圖 3可見，空質粒組及PYNOD單獨處理組與 LPS 組相比較，iNOS的 mRNA 幾乎沒有表達。而各PYNOD轉染組不同程度地降低了LPS誘導小膠質細胞iNOS mRNA 表達，呈現一定劑量依賴效應。0.1 μg PYNOD轉染組iNOS mRNA的表達量與LPS 組相比較無顯著差異,而0.5 μg和1.0 μg PYNOD轉染組iNOS mRNA 表達量分別為LPS 組的(52.5±2.5)%和(34.3±3.2)%，差異有統計學意義(P<0.05)。該結果提示PYNOD能在 mRNA 水平抑制LPS 誘導的iNOS表達。

Figure 3. Down-regulation effect of PYNOD on the expression of iNOS mRNA in LPS-stimulated BV2 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs LPS alone.

4 PYNOD對LPS激活小膠質細胞表達IL-1β mRNA的影響

通過實時熒光定量PCR 方法觀察PYNOD對IL-1β 轉錄水平的影響，正常組及PYNOD單獨處理組與LPS 組相比較，IL-1β 的mRNA 有少量表達，分為LPS 組的(10.5±2.1)% 和(8.3±3.4 )% ，0.1 μg PYNOD轉染組IL-1β mRNA表達量與LPS 組相比較無顯著差異,而0.5和1.0 μg各PYNOD轉染組對LPS 誘導BV2細胞IL-1β mRNA 生成，出現明顯的抑制作用，表達量與 LPS 組相比較，分別為其表達量的(55.9±6.1)% 和(38.7±4.0)%，差異有統計學差異(P<0.05)。結果提示PYNOD可在mRNA 水平抑制LPS 激活BV2細胞表達IL-1β，見圖4。

5 PYNOD下調LPS激活的BV2細胞iNOS蛋白的表達

iNOS 是合成NO 的關鍵酶，其蛋白表達量與炎癥介質NO 的生成呈正相關，本實驗采用Western blotting觀察PYNOD對LPS激活的BV2細胞iNOS 蛋白表達的影響。單純LPS刺激組，經 LPS 刺激后24 h，iNOS 的表達顯著升高，而經 0.1～1.0 μg PYNOD轉染組的BV2細胞，LPS 誘導的iNOS 表達量明顯降低，呈現劑量依賴效應的下降，該結果提示PYNOD在蛋白水平可顯著抑制LPS激活的BV2細胞表達iNOS，見圖5。

Figure 4. The inhibitory effect of PYNOD on the expression of IL-1β in LPS-stimulated BV2 cells. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs LPS alone.

Figure 5. PYNOD suppressed the production of iNOS protein in LPS-induced BV2 cells.

6 PYNOD下調LPS激活的BV2細胞IL-1β蛋白的表達

單純LPS刺激BV2細胞24 h 后，IL-1β濃度可達到551.5 ng/L，空白對照組為48.2 ng/L，各PYNOD轉染組均對IL-1β的分泌起到了不同程度的降低作用，呈現一定的劑量依賴效應。其中0.1、0.5 μg和1.0 μg PYNOD轉染組IL-1β的濃度分別降至442.0 ng/L、340.6 ng/L和250.3 ng/L，與LPS單獨處理組相比，差異有統計學意義(P< 0.05)。以上結果提示PYNOD可下調LPS 激活的BV2細胞IL-1β蛋白的表達，見圖6。

Figure 6. PYNOD decreased the release of IL-1β in LPS-stimulated BV2 cells. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs LPS alone.

討 論

腦內活化小膠質細胞是引發神經炎癥的重要發病機制之一。作為腦內最主要的免疫細胞，小膠質細胞游走于整個腦組織中，發揮著免疫防御的功能，確保腦組織能夠正常的行使生理功能，當Aβ蛋白、LPS或IFN-γ等刺激小膠質細胞后[9-10]，活化的小膠質細胞通過分泌一系列的炎癥介質(其中包括NO、IL-1β、TNF-α、PGE2、活性氧、IL-6等)和神經毒性物質導致神經元損傷[11-12]。近年來，隨著研究的不斷深入，通過抑制小膠質細胞的活化來緩解神經炎癥，成為研究者所關注的焦點。

NO 的合成由3種同工酶催化：iNOS、神經型一氧化氮合酶(neuronal NOS，nNOS)和內皮型一氧化氮合酶(endothelial NOS，eNOS)。由nNOS和eNOS產生的NO只能持續作用幾分鐘，而由細胞因子及內毒素等誘導產生的iNOS催化生成的NO能夠持續作用數小時[13]。目前研究認為在病理情況下，中樞神經系統炎癥中反應性小膠質細胞過度表達iNOS合成大量的毒性氧自由基NO，它是造成神經元損傷的重要原因[14-15]。IL-1β是IL-1的主要分泌形式[16-17]，是一種調節蛋白，在炎癥和自身免疫性疾病中發揮著重要作用。其中小膠質細胞和巨噬細胞被認為是IL-1β最主要的來源[18]。神經系統變性疾病如AD、PD和MS等，它們的發病機制都與IL-1β的上調密切相關[19-20]。

本實驗選取LPS活化BV2小膠質細胞為實驗模型，研究PYNOD對LPS活化的BV2小膠質細胞釋放炎癥產物的影響。通過實驗發現，轉染PYNOD 0.5 μg和1.0 μg后，可以抑制LPS激活的小膠質細胞炎癥因子NO的釋放，并呈現劑量依賴效應。實時熒光定量PCR實驗證實PYNOD可抑制iNOS和IL-1β 的mRNA表達，差異有統計學意義。Western blotting實驗證實PYNOD可下調iNOS蛋白的表達，結果表明轉染0.5～1.0 μg PYNOD重組質粒對iNOS mRNA和蛋白表達的抑制作用呈一定劑量依賴關系。

本實驗首次發現上調BV2細胞中PYNOD的表達，可通過抑制iNOS 的mRNA和蛋白表達呈劑量依賴方式減輕LPS誘導的NO的生成。PYNOD還可抑制促炎癥因子IL-1β在轉錄水平和蛋白水平的表達。此外，本實驗表明轉染進入BV2細胞的PYNOD在發揮減輕炎癥反應的同時對細胞本身無明顯的毒性作用。以上結果表明PYNOD有可能在伴有小膠質細胞活化的神經變性疾病的治療中發揮重要作用，具有重要的潛在價值。

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