田旋花EPSPS基因啟動子的克隆、序列分析及轉化

黃兆峰， 周欣欣， 黃紅娟， 魏守輝， 陳景超， 楊 龍， 陳金奕， 張朝賢

(1.中國農業科學院植物保護研究所/中國農業科學院雜草鼠害生物學與治理重點實驗室，北京 100193；2.農業部農藥檢定所，北京 100193)

草甘膦是一種廣譜滅生性、內吸傳導型除草劑，是國內外防除一年生及多年生雜草的主要藥劑[1-6]。草甘膦的作用機制是抑制植物體內5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)的活性，導致莽草酸大量積累，并抑制芳香族氨基酸的生物合成，進而擾亂正常的氮代謝[7]。以往研究表明：植物體內EPSPS基因的過量表達可以有效提高其對草甘膦的耐藥性[8-11]。

田旋花(ConvolvulusarvensisL.)屬旋花科，是一種多年生惡性雜草，其繁殖和再生能力極強，是華北地區小麥、玉米、大豆等旱作物田的重要雜草[12]。已被世界糧農組織列為世界上18種危害最嚴重的雜草之一[13]。DeGennaro等研究發現，無草甘膦用藥史的田旋花對草甘膦具有天然的耐藥性[14]；劉延等發現，北京房山麥田田旋花對草甘膦具有較高的耐藥性，并首次克隆了田旋花EPSPS基因(GenBank登錄號：EU698030)[12]；張猛比較了不同田旋花種群的耐藥性水平，提出草甘膦處理后的EPSPS基因在表達時間和表達量上的差異是其對草甘膦產生耐藥性差異的一個重要因素[13]。

本試驗利用染色體步移技術克隆了田旋花EPSPS基因的啟動子序列，并對其結構進行了分析。用該啟動子與GUS報告基因連接轉化農桿菌，花序侵染法侵染擬南芥，獲得轉EPSPS-P啟動子擬南芥，為進一步了解田旋花EPSPS基因的表達調控機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 田旋花種子采自北京市海淀區上莊鎮；擬南芥種子由筆者所在實驗室保存。

1.1.2 質粒和菌株 大腸桿菌DH5α購自全式金公司；質粒pBI121、農桿菌GV3101由中國農業科學院畜牧研究所晁躍輝博士惠贈。

1.1.3 試驗試劑 Genome Walking Kit，T4連接酶，限制性內切酶Hind Ⅲ、XbaⅠ，PMD19-T載體，均購自TaKaRa公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 取田旋花新鮮葉片，用CTAB方法提取總DNA，作為克隆田旋花EPSPS基因啟動子的模板。產物濃度和純度用紫外分光光度計檢測，同時在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測DNA的完整性，以進一步確定DNA的質量。

1.2.2 啟動子克隆 根據NCBI上已發表的田旋花EPSPS核苷酸序列設計3條特異引物：GW-1：5′-AGAGAGATTGCTGGGGCTCAAACGC-3′；GW-2：5′-GAGGTTTAGAGAGATTGCTGGGGCT -3′；GW-3：5′-CCCACCAAATTCAATTAAGAGGTTT-3′。 引物由北京博邁德科技發展有限公司合成。

根據Genome Walking Kit的說明，采用3輪嵌套式反應程序。在第1輪反應中，分別以AP1、AP2、AP3為上游引物，GW-1為下游引物，反應程序為：95 ℃預變性1 min；94 ℃ 30 s、65 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，5個循環；94 ℃ 30 s、25 ℃ 3 min、72 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、65 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min、94 ℃ 30 s、65 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、44 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，15個循環；72 ℃延伸10 min。反應完成后，將上述PCR反應產物稀釋10倍用作第2輪PCR擴增的模板，第2輪PCR反應分別以AP1、AP2、AP3為上游引物，GW-2為下游引物，進行PCR擴增，反應程序為：94 ℃ 30 s、65 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、65 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min、94 ℃ 30 s、44 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，15個循環；72 ℃延伸10 min。第3輪PCR反應分別以AP1、AP2、 AP3為上游引物，GW-3為下游引物，反應程序與第2輪反應一致。所得最終PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過膠回收純化后與 pMD19-T 連接，轉化大腸桿菌后送北京博邁德科技發展有限公司測序。

1.2.3 序列的生物信息學分析 將測序結果在NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)網站上進行BLAST比對。同時在PlantCARE (http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)上進行在線預測，分析存在的TATA-box、CAAT-box以及其他作用元件。

1.2.4EPSPS-P啟動子和GUS基因植物表達載體的構建 根據已得到的啟動子序列設計2條特異性引物：EPS-P-F：5′-AAGCTTAAACCTCTTAATTGAAT-3′(含HindⅢ酶切位點)和EPS-P-R：5′-TCTAGAGGTATTTTAAAAGAGGC-3′(含XbaⅠ酶切位點)，將PMD- EPSPS-P、pBI121分別用限制性內切酶HindⅠ、XbaⅠ進行雙酶切，回收啟動子片段，然后用T4酶連接至酶切后的pBI121中。使EPSPS-P替換pBI121中的35S啟動子，得到EPSPS-P與載體中GUS報告基因相連的雙元表達載體pBI-EPSPS-P。采用氯化鈣凍融法將pBI-EPSPS-P導入農桿菌后，用農桿菌轉化擬南芥。

1.2.5 轉基因擬南芥GUS活性檢測[15]將轉基因擬南芥葉片用無菌水沖洗干凈后放入GUS染液中，抽真空至材料表面產生少許氣泡并被染液完全淹沒為止，37 ℃過夜，用脫色液脫色后在體視顯微鏡下觀察染色結果。GUS染液配方：50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH值7.0)，5 mmol/L鐵氰化鉀，5 mmol/L 亞鐵氰化鉀，0.1% Triton X-100，1 mmol/L X-Gluc。脫色液配方：乙醇 ∶乙酸=3 ∶1。

2 結果與分析

2.1 EPSPS-P啟動子片段的獲得

利用染色體步移方法，通過3輪PCR擴增，得到了長約1.2 kb的DNA片段，將得到的大片段回收、測序，結果顯示，該DNA片段長1 145 bp，排除與已知的田旋花EPSPS基因序列重疊部分，實際獲得的啟動子片段為1 142 bp(圖1)，可以看出該序列富含A/T，是啟動子序列的重要特征之一。

2.2 啟動子的生物信息學分析

通過PlantCARE對獲得的啟動子序列進行分析，結果(圖2)表明，EPSPS-P啟動子序列中含有典型的啟動子基本元件，如TATA-box 和CAAT-box，其中TATA-box(RNA聚合酶II結合位點)位于起始密碼子ATG上游-40～-36。TATA-box近端的1個脅迫響應元件TC-rich repeats區位于-692～-683；此外，還有與光效應有關的元件 Sp1、GATA-motif，以及生理節奏控制元件circadian，該EPSPS基因啟動子GenBank的登錄號為KC107822。

2.3 植物表達載體的構建及轉基因擬南芥的獲得

將含有啟動子的pMD19-T質粒和pBI121的載體分別用HindⅢ、XbaⅠ雙酶切，電泳圖譜結果見圖3-A；回收啟動子片段，然后用T4連接酶連接至酶切后的pBI121上，經酶切鑒定(圖3-B)后轉化大腸桿菌DH5α。菌落經PCR擴增，初步鑒定基因已連接于載體上。挑選陽性菌落搖菌并提取質粒，用Hind Ⅲ和XbaⅠ進行雙酶切鑒定，得到的目的片段大小與預測一致。經測序表明，得到的序列完全正確，植物表達載體pBl121-EPSPS-P構建成功。用凍融法將構建的植物表達載體PBl121-EPSPS-P導入根癌農桿菌GV3101中，挑取陽性菌落搖菌，提取質粒DNA并進行雙酶切鑒定，得到2個條帶，且大小與預期一致，說明植物表達載體pBl121-EPSPS-P已成功轉入農桿菌中。用花序浸染法侵染擬南芥花序，收獲種子后在含50 mg/L卡那霉素的培養基上篩選抗性苗，挑取抗性苗移栽至花盆中繼續培養。

2.4 轉基因擬南芥鑒定與GUS活性檢測

為了檢測EPSPS-P啟動子是否轉入擬南芥中，分別提取轉基因擬南芥葉片基因組DNA，進行PCR驗證。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示均呈陽性，而野生型(WT)無特異性條帶(圖4)。此外。對WT和轉基因擬南芥葉片進行GUS組織化學染色，由圖5可以看出，染色后WT無色，而轉基因擬南芥呈藍色。表明EPSPS-P已成功轉化到擬南芥中，并能啟動GUS報告基因的表達。

3 討論與結論

本研究采用染色體步移技術，通過3輪嵌套式PCR，克隆到長度為1 142 bp的田旋花EPSPS基因啟動子片段，用啟動子預測軟件PlantCARE對該啟動子片段進行分析發現，該片段除了具有啟動子保守元件TATA-box及CAAT-box外，還有其他一些作用元件，如TC-rich repeats(脅迫響應元件)、spl(光響應元件)、GATA-motif(光響應元件)、CCAAT-motif(MYBHvl binding site)等。研究表明，EPSPS主要分布在葉綠體中[16-17]，而葉綠體是光合作用的主要場所。在對陸地棉的研究中發現，EPSPS基因在其成熟葉片中表達量最高[18]。通過對啟動子分析發現，田旋花EPSPS啟動子含有2個光響應原件，這與EPSPS的分布和表達特征相符合。

很多化學誘導劑對植物的影響都是通過直接或間接地作用于植物的啟動子而調控植物基因的表達，從而影響植物的生長、發育、生殖，以及植物對內外環境的反應[19]。以往的研究表明，田旋花在噴施草甘膦后，EPSPS基因在轉錄水平明顯提高[14]。因此筆者從田旋花EPSPS基因啟動子入手，克隆并通過農桿菌介導法得到了轉EPSPS-P擬南芥，為進一步探究田旋花耐藥性機制，以及EPSPS基因的表達調控提供了試驗依據。

啟動子驅動基因表達需要多個順式元件，這些元件的種類、數量及彼此之間的順序與距離，都可能影響基因的轉錄與否或轉錄水平[20]。目前，缺失分析法是研究啟動子功能的一種重要的方法。通過5′缺失法獲得不同長度的啟動子片段，分別與GUS報告基因融合構建植物表達載體并轉入擬南芥，對田旋花EPSPS基因啟動子的誘導活性進行研究，從而明確其在草甘膦等處理條件下的調控元件，將是下一步的重點研究內容。

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