真武湯對腎間質(zhì)纖維化大鼠纖維連接蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)的研究

周波，宋立群，贠捷，張丹萍，宋業(yè)旭，馬艷春，陳方明

(1.四川省達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，四川 達(dá)州 635002;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;4.四川省達(dá)州市畜禽繁育改良站，四川 達(dá)州 635000)

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是各種腎病進(jìn)展到終末期腎病的基礎(chǔ)，RIF的發(fā)生涉及炎性細(xì)胞浸潤、腎小管損傷、腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積等過程［1］，我們的研究結(jié)果與此相符。纖維連接蛋白(FN)是腎間質(zhì)纖維化的一個(gè)重要蛋白酶，基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP－9)是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解酶之一，能夠降解完整的基底膜，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的形成。本研究將探討真武湯對腎間質(zhì)纖維化模型大鼠腎組織FN和 MMP－9蛋白表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和藥品

SPF級Wistar雄性健康大鼠150只，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)提供，體質(zhì)量為180～200g。真武湯所需飲片由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供;尿毒清顆粒(廣州康臣藥業(yè)有限公司)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

切片機(jī)(德國Leica公司，2135型);光學(xué)顯微鏡(日本，OLYMPUS);成像系統(tǒng)(美國 moticam公司，Moticam3000型);圖像分析軟件(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)。

1.3 腎間質(zhì)纖維化模型制作

將150只大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周，10%水合氯醛麻醉，常規(guī)備皮、消毒，以左側(cè)肋腰點(diǎn)為手術(shù)切口，將左側(cè)腎臟及腎蒂充分暴露，仔細(xì)分離出輸尿管，將輸尿管結(jié)扎，假手術(shù)組不結(jié)扎輸尿管，余同模型組，逐層縫合并消毒。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

將150只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型復(fù)制組，將模型復(fù)制后的大鼠隨機(jī)分為模型組、真武湯低劑量組、中劑量組、高劑量組和尿毒清組，其中假手術(shù)組和模型組21只，其余各組27只。

1.5 給藥劑量及方法

真武湯組方和劑量參考《方劑學(xué)》(第五版)教材，低、中、高劑量組分別為 7g/(kg·d)、14g/(kg·d)、28g/(kg·d)，尿毒清顆粒:根據(jù)文獻(xiàn)劑量為3.75g/(kg·d)。從術(shù)后第1天開始給藥，每天灌服1次，假手術(shù)組和模型組給予等量的生理鹽水，分別連續(xù)灌服2周、3周和4周。

1.6 標(biāo)本收集及檢測

實(shí)驗(yàn)分為給藥2周、3周和4周三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行研究，于給藥后的第2周、3周、4周末隨機(jī)處死并取材，假手術(shù)組和模型組各6只，其余各組8只，收集腎臟組織標(biāo)本，常規(guī)固定，石蠟包埋，采用HE染色法進(jìn)行檢測，以百分比評分法對梗阻側(cè)腎臟進(jìn)行腎小管損傷和腎間質(zhì)纖維化程度進(jìn)行評估，每組分別選取10個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)算腎小管損傷比例;采用美國Motic image 3.2圖像分析系統(tǒng)對腎間質(zhì)纖維化程度分析和評估。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組腎臟組織FN蛋白表達(dá)比較

假手術(shù)組腎小管上皮細(xì)胞有少量FN蛋白的表達(dá)，模型組的腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞可見FN蛋白的陽性表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組FN蛋白的表達(dá)隨著研究時(shí)間的延長而逐漸增強(qiáng)，與模型組比較，各藥物組FN的蛋白表達(dá)均低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組FN蛋白表達(dá)趨勢與模型組一致，各藥物組中，真武湯中劑量組FN蛋白的表達(dá)最弱，真武湯中劑量組與尿毒清組蛋白表達(dá)水平一致。結(jié)果見表1和圖1。

2.2 各組腎臟組織MMP－9蛋白表達(dá)比較

假手術(shù)組可見少量MMP－9蛋白的表達(dá)，模型組可見大量MMP－9蛋白的陽性表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與模型組比較，各藥物組MMP－9的蛋白表達(dá)均低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組MMP－9蛋白表達(dá)趨勢與模型組一致，各藥物組中，真武湯中劑量組MMP－9蛋白的表達(dá)最弱，真武湯中劑量組與尿毒清組蛋白表達(dá)水平一致。結(jié)果見表2和圖2。

表1 各組腎組織FN免疫組化表達(dá)量(s，平均光密度×10－2)

表1 各組腎組織FN免疫組化表達(dá)量(s，平均光密度×10－2)

注:與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05，bP ＜0.01;與模型組比較，dP ＜0.05，eP ＜0.01;與真武湯中劑量組比較，fP ＞0.05。

組別 視野數(shù) 2周 3周 4周假手術(shù)組10 11.04 ±1.00 11.12 ±1.03 11.08 ±0.98模型組 10 14.38 ±1.36a 17.63 ±1.57b 20.57 ±1.91b低劑量組 10 12.83 ±1.15d 15.18 ±1.37d 16.34 ±1.45d中劑量組 10 12.11 ±1.08d 13.64 ±1.21e 14.22 ±1.21e高劑量組 10 13.36 ±1.12d 14.56 ±1.35d 15.43 ±1.20d尿毒清組 10 12.05 ±1.10d☆ 13.65 ±1.26ef14.05 ±1.20ef

表2 各組腎組織MMP－9免疫組化表達(dá)量(s，平均光密度×10－2)

表2 各組腎組織MMP－9免疫組化表達(dá)量(s，平均光密度×10－2)

注:與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05，bP ＜0.01，cP ＜0.001;與模型組比較，dP ＜0.05，eP ＜0.01;與真武湯中劑量組比較，fP ＞0.05。

組別 視野數(shù) 2周 3周 4周假手術(shù)組10 12.26 ±1.15 12.34 ±1.20 12.25 ±1.03模型組 10 16.85 ±1.51a 18.67 ±1.65b 21.36 ±1.92c低劑量組 10 15.63 ±1.34d 16.68 ±1.53d 17.39 ±1.56d中劑量組 10 14.25 ±1.26d 15.13 ±1.28d 15.89 ±1.43e高劑量組 10 15.22 ±1.38d 15.86 ±1.43d 16.57 ±1.51d尿毒清組 10 14.07 ±1.25d☆ 15.02 ±1.35df15.28 ±1.25ef

圖1 各組大鼠腎組織FN免疫組化(×400)

圖2 各組大鼠腎組織MMP－9免疫組化(×400)

3 討論

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是由多種細(xì)胞及細(xì)胞因子共同參與，涉及炎性細(xì)胞浸潤、腎小管損傷、成纖維細(xì)胞的增殖等過程，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積而形成腎間質(zhì)纖維化［1－2］，我們的研究結(jié)果與此相符，在其他文章中闡述。

FN是重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，對纖維蛋白、纖維蛋白原和膠原有較強(qiáng)的結(jié)合能力，能夠?qū)?xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生量和質(zhì)的改變，F(xiàn)N的蛋白表達(dá)可以反映細(xì)胞外基質(zhì)的沉積程度，是腎間質(zhì)纖維化的一個(gè)重要標(biāo)志［3］。MMP－9又稱明膠酶，是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解酶之一，是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡的重要酶類主要降解明膠、Ⅳ、Ⅴ等型膠原及層黏連蛋白等，能降解完整的基底膜，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的形成［4］。

在本研究中，假手術(shù)組可見少量FN和MMP－9蛋白的表達(dá)，模型組可見大量FN和MMP－9蛋白的陽性表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，F(xiàn)N和MMP－9蛋白的表達(dá)隨著研究時(shí)間的延長而逐漸增強(qiáng)，說明梗阻時(shí)間越長，F(xiàn)N和MMP－9蛋白的表達(dá)越強(qiáng)，腎間質(zhì)纖維化程度越重，與模型組比較，各藥物組FN和MMP－9蛋白表達(dá)均低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明真武湯能夠抑制FN和MMP－9蛋白的表達(dá)，能夠抑制腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，各藥物組中，真武湯中劑量組FN和MMP－9蛋白表達(dá)最弱，真武湯中劑量組與尿毒清組蛋白表達(dá)水平一致。

綜上所述，真武湯能夠抑制腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織中FN和MMP－9蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮真武湯延緩或阻斷腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程，其中真武湯中劑量組的效果最佳。

［1］Boor P，Ostendorf T，F(xiàn)loege J.Renal fibrosis:novel insights into mechanisms and therapeutic targets［J］.Nat Rev Nephrol，2010，6(11):643－656.

［2］宋立群，馬曉鵬，宋業(yè)旭，等.差異蛋白組學(xué)在中醫(yī)藥防治腎間質(zhì)纖維化中的應(yīng)用展望［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2013，41(6):90 －92.

［3］Chen Z，Chen D，McCarthy TL，et al.Inorganic phosphate stimulates fibronectin expression in renal fibroblasts［J］.Cell Physiol Biochem，2012，30(1):151 －159.

［4］韓園園，魏仲南.MMP－9/TIMP－1在腎間質(zhì)纖維化過程中的作用機(jī)制及中醫(yī)藥對其干預(yù)的研究進(jìn)展［J］.中國醫(yī)藥指南，2013，11(3):40－41.