刺五加注射液誘發過敏反應類型的實驗研究

馮宇飛，井中旭

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001)

目前，臨床上報道的中藥注射劑的不良反應癥狀多為皮疹、頭暈、頭痛、發熱、心慌、胸悶、水腫、休克等癥狀［1］，多在用藥后30min內出現，上述過敏癥狀可歸屬為急性過敏反應。多數學者將急性過敏反應分為Ⅰ型超敏反應和類過敏反應，前者由IgE介導，需多次致敏后激發才會產生過敏樣癥狀，而后者癥狀的產生與IgE無關，且首次接觸即可發生反應，二者臨床癥狀類似，但作用機理完全不同［2］。為了探討刺五加注射液致敏反應類型，建立可靠、靈敏的致敏物質篩選方法，尋找防治刺五加注射液不良反應的途徑和方法，本實驗通過對刺五加注射液豚鼠致敏后血清總IgE、IL－4、IFN－γ水平、全血嗜酸性粒細胞的數量的測定，同時對各組致敏后豚鼠經抗原激發后的肺組織進行病理切片檢查，確定刺五加注射液的過敏反應類型，為進一步研究其致敏物質基礎提供實驗依據。

1 試藥與儀器

刺五加注射液(×××藥廠提供，批號20100208、20100309、20100402、20100601、20100702、20100903);弗氏完全佐劑(Sigma公司進口分裝);弗氏不完全佐劑(Sigma公司進口分裝);卵白蛋白(Sigma公司進口分裝);高速低溫離心機(日本日立公司，R21型);渦旋混勻器(蘇州捷美電子有限公司，HYQ－2121A型);豚鼠總IgE試劑盒;豚鼠IL－4試劑盒;豚鼠INF－r試劑盒;全自動生化分析儀(EBS－240型，淄博恒拓分析儀器有限公司);酶標儀(美國Molecular Devices公司，SPECTRAMAX 190型);透射電鏡(TECNAI G2型，荷蘭);高速冷凍離心機(TGL16M型，長沙)。

2 實驗動物

白毛豚鼠，英國種，雌雄兼用，體質量(280±30)g，清潔級，由黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心提供，合格證號為SCXK(黑)2008004號。

3 實驗方法

3.1 實驗分組

將豚鼠隨機分組，分別為陰性對照組(NS組)、陽性對照組(OVA 1mg/只)、刺五加注射液凍干粉(自制)6 個批號下分設低、高(15.4mL/kg、61.6mL/kg)兩個劑量組，每組6只。

3.2 致敏及抗血清制備

豚鼠適應性飼養5天后，將各組實驗藥物與弗氏佐劑以1:1混合，研磨均勻后分別注射于足掌及肘窩淋巴結周圍，背部兩側、頜下、耳后等處，給藥總體積為1mL/只，致敏途徑為皮下注射，隔日1次，共免疫3次。每組分別于末次致敏后14天，心臟取血，室溫自然凝 固，6000rpm/min、離 心 20min，分 離 血 清，置－20℃冰箱備用。

3.3 豚鼠血清中總IgE水平的測定

采用豚鼠ELISA總IgE測定試劑盒，雙抗夾心法對豚鼠抗血清中總IgE水平進行測定，記錄各組OD值，具體步驟如下:分別設標準孔、待測樣品孔。標準孔內加不同濃度的標準品，樣品孔先加待測樣本，再加樣本稀釋液，空白孔不加。除空白孔外，標準品孔和樣品孔每孔加辣根過氧化物酶標記抗豚鼠IgE抗體工作液，37℃，60min。棄去液體，甩干，不用洗滌。溫育60min后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，甩干。依序每孔加底物溶液，37℃避光顯色。依序每孔加終止溶液，終止反應，用酶標儀在450nm波長依序測量各孔的OD值。

3.4 致敏豚鼠血清中IL－4的測定

每孔分別加入豚鼠IL－4標準品或待測樣品，將已包被好的酶標板充分混勻后，每孔中加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體。將反應板充分混勻后置37℃，60min，用洗滌液將反應板充分洗滌5次，濾紙上印干。每孔加入底物A、B液，置37℃暗處反應15min。每孔加入終止液混勻。用酶標儀在450nm測吸光度值。以各標準品的濃度為縱坐標，A值為橫坐標，繪制標準曲線。將各待測樣品的A值代入標準曲線，算出相應的濃度值。

3.5 致敏豚鼠血清中IFN－γ的測定

每孔分別加入豚鼠IFN－γ標準品或待測樣品，將已包被好的酶標板充分混勻后，每孔中加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體。將反應板充分混勻后置37℃，60min，用洗滌液將反應板充分洗滌5次，濾紙上印干。每孔加入底物A、B液，置37℃暗處反應15min。每孔加入終止液混勻。用酶標儀在450nm測吸光度值。以各標準品的濃度為縱坐標，A值為橫坐標，繪制標準曲線。將各待測樣品的A值代入標準曲線，算出相應的濃度值。

3.6 致敏豚鼠全血中嗜酸性粒細胞檢查

應用全自動生化儀對致敏豚鼠血清中的嗜酸性粒細胞數量進行測定，統計學軟件對各組嗜酸性粒細胞的數量進行分析。

3.7 致敏豚鼠肺部病理切片檢查

豚鼠經各組抗原激發后進行解剖，取帶有一小塊支氣管的肺部切片經過脫水、浸臘、包埋，最后HE染色，電鏡下觀察各組藥物對豚鼠致敏后所致的肺、氣管、細支管的形態學變化。

3.8 統計學處理

記錄各組OD值及嗜酸性粒細胞數量，通過標準曲線計算各組抗血清中總IgE、IL－4、IFN－γ水平，以(s)表示，SPSS 16.0統計學軟件進行t檢驗，以P＜0.05為統計學上有顯著性差異標準。

4 結果

4.1 致敏豚鼠總IgE、IL－4、IFN－γ測定結果

采用 ELISA法對各組致敏豚鼠總 IgE、IL－4、IFN－γ各項指標測定，經標準曲線換算后的結果，如表1～3所示，嗜酸性粒細胞測定結果如表4所示。與空白組相比，陽性對照組及刺五加注射液(20100702)高劑量組致敏豚鼠血清總IgE、IL－4、IFN－γ具有顯著性差異，但嗜酸性粒細胞數量未見顯著性差異。

4.2 病理切片結果

比較各組刺五加注射液與生理鹽水組的豚鼠肺部病理切片發現，批號為20100702的刺五加注射液高劑量組豚鼠肺部出現肺泡壁毛細血管擴張充血，肺泡腔內有少量液體滲出，細支氣管腔內有炎性滲出物，其周圍可見淋巴細胞浸潤等輕微病變;而生理鹽水組肺泡壁毛細血管無明顯充血，肺泡腔內無液體滲出，切片結果見圖1。

圖1 刺五加注射液(20100702)高劑量組致敏豚鼠肺切片(100×)

表1 各實驗組豚鼠總IgE水平比較(s，μg/mL，n=6)

表1 各實驗組豚鼠總IgE水平比較(s，μg/mL，n=6)

注:與生理鹽水組相比，*P ＜0.05。

組別 劑量 IgE 水平卵白蛋白組 73.91 ±3.82*28.11 ±8.03生理鹽水組 23.65 ±5.96刺五加注射液 L 27.87 ±4.32(20100208)H 29.43 ±6.42刺五加注射液 L 29.57 ±7.84(20100309)H 29.17 ±7.53刺五加注射液 L 29.02 ±5.23(20100402)H 28.93 ±6.44刺五加注射液 L 24.61 ±4.95(20100601)H 27.05 ±5.76刺五加注射液 L 30.48 ±6.23(20100702)H 43.91 ±7.36*刺五加注射液 L 27.30 ±5.93(20100903)H

表2 各實驗組豚鼠IL－4水平比較(s，pg/mL，n=6)

表2 各實驗組豚鼠IL－4水平比較(s，pg/mL，n=6)

注:與生理鹽水組相比，*P ＜0.05。

水平卵白蛋白組 6.16 ±0.77組別 劑量 IL－4*生理鹽水組 3.58 ±0.53刺五加注射液 L 3.67 ±0.42(20100208)H 3.43 ±0.61刺五加注射液 L 3.57 ±0.48(20100309)H 3.77 ±0.73刺五加注射液 L 3.62 ±0.63(20100402)H 3.73 ±0.74刺五加注射液 L 3.87 ±0.93(20100601)H 3.78 ±1.00刺五加注射液 L 3.98 ±0.91(20100702)H 4.31 ±0.96*刺五加注射液 L 3.63 ±0.90(20100903)H 3.61 ±0.83

表3 各實驗組豚鼠IFN－γ水平比較(s，pg/mL，n=6)

表3 各實驗組豚鼠IFN－γ水平比較(s，pg/mL，n=6)

注:與生理鹽水組相比，*P ＜0.05。

組別 劑量 IFN－γ水平卵白蛋白組 12.11 ±1.26*16.11 ±4.02生理鹽水組 16.18 ±2.31刺五加注射液 L 17.07 ±2.29(20100208)H 16.43 ±3.57刺五加注射液 L 16.49 ±3.48(20100309)H 15.97 ±3.34刺五加注射液 L 16.02 ±3.11(20100402)H 16.93 ±4.00刺五加注射液 L 16.71 ±3.58(20100601)H 17.00 ±4.67刺五加注射液 L 10.49 ±1.54(20100702)H 10.01 ±1.76*刺五加注射液 L 16.30 ±3.98(20100903)H

表4 各實驗組豚鼠嗜酸性粒細胞數量比較(s，n=6)

表4 各實驗組豚鼠嗜酸性粒細胞數量比較(s，n=6)

注:與生理鹽水組相比，*P ＜0.05。

組別 劑量 嗜酸性粒細胞數量(×109)卵白蛋白組 0.51 ±0.24*0.10 ±0.03生理鹽水組 0.10 ±0.04刺五加注射液 L 0.09 ±0.02(20100208)H 0.11 ±0.04刺五加注射液 L 0.09 ±0.01(20100309)H 0.08 ±002刺五加注射液 L 0.09 ±0.02(20100402)H 0.08 ±0.02刺五加注射液 L 0.09 ±0.02(20100601)H 0.10 ±0.03刺五加注射液 L 0.11 ±0.03(20100702)H 0.10 ±0.03刺五加注射液 L 0.09 ±0.02(20100903)H

5 討論

IgE是人體五種免疫球蛋白中含量最低的，IgE介導Ⅰ型變態反應抗體，生理情況下含量極低，在健康人群中呈偏態分布。血清中總IgE的測定對尋找過敏原及認定過敏反應類型具有重要意義，可以初步認定中藥注射劑的Ⅰ型過敏反應。細胞因子是一大類能在細胞間傳遞信息，具有免疫調節和效應功能的蛋白質或小分子多肽。IL－4由抗原或絲裂原刺激的CD4+T細胞產生，活化的肥大細胞亦可產生IL－4。IFN－γ由CD8+T細胞和某些CD4+T細胞產生，NK細胞亦可合成少量的IFN－γ，IFN－γ不僅抑制TH2型細胞產生IL－4，而且抑制IL－4對B細胞的作用，特別是抑制B細胞生成IgE。因此本研究選擇了致敏豚鼠血清中總IgE、IL－4、IFN－γ水平做為Ⅰ型過敏反應的檢測指標，判斷刺五加注射液的致Ⅰ型過敏反應作用。

采用ELISA法檢測不同批次刺五加注射液致敏豚鼠后總IgE、IL－4、IFN－γ水平的變化。ELISA實驗顯示，經過免疫后某些批次刺五加注射液高劑量組豚鼠血清總IgE、IL－4、IFN－γ水平與生理鹽水組比較，具有統計學差異(P＜0.05)。病理切片結果顯示，正常組豚鼠肺泡壁毛細血管無明顯充血，肺泡腔內無液體滲出。某些批次刺五加注射液高劑量組豚鼠的肺部病理切片顯示，肺泡腔內出現液體滲出、肺組織實變，肺泡壁毛細血管擴張充血，肺泡腔內有液體滲出，肺水腫，細支氣管腔內有炎性滲出。推測是由于過敏反應肥大細胞釋放的組胺增加了血管通透性導致炎癥反應所致。本實驗中，致敏豚鼠全血中嗜酸性粒細胞數量與空白組相比，無顯著性差異，結合IgE、IL－4、IFN－γ水平的變化以及病理切片結果證明刺五加注射液所引起的過敏反應符合Ⅰ型過敏反應特征，判斷為Ⅰ型過敏反應。

［1］馬志強，蔡程科，劉璐，等.凝膠色譜法對舒血寧注射液中高分子量物質的檢查［J］.中醫藥學報，2013，41(3):31 －32.

［2］張玉生，史艷秋，王建華.中藥注射劑過敏反應非臨床評價方法［J］.中草藥，2009，40(2):313－315.