抵當顆粒劑體外抗凝血與抗血栓作用的研究

梁珊珊，呂金南，張瑞光，孫小文，郭晶，侯慧，徐炳清，王秋紅，匡海學

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

抵當湯出自《傷寒論》，見于“太陽病，六七日表證仍在，脈微而沉，反不結胸，其人發狂者，以熱在下焦，少腹當硬滿，小便自利者，下血乃愈。所以然者，以太陽隨經，瘀熱在里故也，抵當湯主之”。方劑組成為水蛭、虻蟲、桃仁、大黃，破血逐瘀之功效甚強，主治下焦瘀熱證［1］，癥狀為少腹急結或疼痛固定不移、或拒按、大便失常，其色如柏油，小便自利，發狂，或喜忘、或起臥不安、或身黃等?，F代臨床將抵當湯進行改良后應用于腦血管病變，代謝綜合征，周圍血管癥，婦科疾病等，主要取活血化瘀的功效［2］。本實驗室根據臨床經驗，并參考《傷寒論》以抵當湯為基礎，結合現代臨床用藥，制成抵當顆粒劑，對其活血化瘀的各項功能指標進行研究。

1 材料與儀器

1.1 動物

新西蘭大耳白兔，雄性，體質量(2.5 ±0.2)Kg，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.2 藥品與試劑

凝血酶、牛纖維蛋白原(北京索萊寶科技有限公司);生理鹽水(哈爾濱三聯藥業);枸櫞酸鈉(北京康普匯維科技有限公司);自制抵當顆粒劑(由黑龍江中醫藥大學中藥化學教研室自制)。

1.3 實驗儀器

恒溫水浴鍋(武漢明思克化儀器有限公司);電熱恒溫培養箱HH·B11·500(上海躍進醫療器械廠);分析天平(BSA2245，德國賽多利斯集團)。

2 試驗方法

2.1 實驗藥品的制備

用去離子水精確配制抵當顆粒劑樣品的濃度，分別為 100.0、250.0、500.0、750.0μg/mL 和 1.0、2.0、3.0、4.0mg/mL，分別標記為 A，B，C，D，E，F，G，H，并于冰箱內保存，供實驗用。

2.2 體外抗凝血作用［3］

2.2.1 對家兔血漿復鈣時間的影響

家兔耳緣靜脈取血4.5mL，加至含有38g/L枸櫞酸鈉0.5mL的10mL離心管中，混勻，3000r/min離心10min，取上清液，4℃備用。另取96孔板1個，實驗組每孔加入混合血漿0.1mL及不同質量濃度的樣品溶液各0.1mL，對照組加入混合血漿0.1mL及生理鹽水0.1mL，于37℃溫育1min后分別向每孔加入2.775g/L CaCl2溶液0.1mL后開始計時，直到檢測到纖維蛋白絲時停止計時，重復10次，求平均值，即為血漿復鈣時間。

2.2.2 對凝血酶時間的影響

按“2.2.1”項的方法制備混合血漿，在96孔板中加入混合血漿和不同質量濃度(同“2.2.1”項)的樣品溶液各0.1mL，37℃溫育3min，再加入已預溫的1×104U/L凝血酶0.1mL，混勻，記錄血漿凝固所需的時間。以生理鹽水為對照組，每組重復10次，取平均值。

2.3 體外抗血栓作用［3］

2.3.1 溶栓作用

家兔頸總動脈采血于試管中，按體積比為1∶9加入質量濃度為38g/L枸櫞酸鈉溶液，然后依次加入纖維蛋白原溶液(質量分數為 0.5%)、CaCl2溶液(55.5g/L)和凝血酶溶液(1.0×105U/L)，加入量為每毫升血中加入纖維蛋白原溶液20μL、CaCl2溶液10μL和凝血酶溶液20μL?；靹蚝?，注入到內徑為8mm的玻璃試管中，37℃水浴20min后取出血栓，用濾紙吸干，切成5mm的小段，放入裝有不同質量濃度(同“2.2.1”項)的樣品溶液和生理鹽水2mL的試管中，37℃溫育，于 0、4、12、24、48h 內分別測定剩余血栓段的質量，計算血栓溶解率［4］，各藥物重復測定10次。

血栓溶解率(%)=(血栓初始質量－藥物作用后各時間點血栓質量)/血栓初始質量×100%

2.3.2 對全血凝塊的溶解作用

家兔頸總動脈采血20mL置于表面皿中，2h后自然凝固后切成0.3cm3的小塊，用生理鹽水淋洗3遍待用。將不同質量濃度(同“2.2.1”項)的樣品溶液和生理鹽水各2mL分別加入不同的安瓿瓶中，每組5小瓶，再向各瓶中隨機加入2個血塊，37℃水浴保溫，觀察血塊溶解情況，并分別于0、12、24、48h分別測定血塊的質量，計算全血凝塊溶解率。

全血凝塊溶解率(%)=(血凝塊初始質量－藥物作用后各時間點血凝塊質量)/血凝塊初始質量 ×100%

3 實驗結果

3.1 體外抗凝血作用

3.1.1 對家兔血漿復鈣時間的影響

如表1所示，與對照組比較，低劑量組無顯著性差異;隨著濃度的增大，抵當顆粒組能延長家兔血漿復鈣時間，具有顯著性，且呈量效關系。

3.1.2 對凝血酶時間的影響

如表1所示，抵當顆粒劑具有延長凝血酶時間的作用，隨濃度的增加作用越顯著，且呈量效關系。

表1 抵當顆粒劑對家兔血漿復鈣時間及凝血酶時間的影響(s，n=10)

表1 抵當顆粒劑對家兔血漿復鈣時間及凝血酶時間的影響(s，n=10)

注:與對照組比較，*P ＜0.01，＊＊P ＜0.05。

組別 濃度(mg/ml)血漿復鈣時間(s)凝血酶時間(s)對照組41.99 ±3.13 90.27 ±8.95 A 0.10 43.86 ±4.91 101.55 ±8.66 B 0.25 46.78 ±5.17 104.69 ±9.71 C－0.50 52.26 ±7.20＊＊ 110.45 ±12.10＊＊D 0.75 57.13 ±7.87* 117.28 ±13.79*E 1.00 63.06 ±8.32* 125.68 ±15.84*F 2.00 71.25 ±9.67* 138.64 ±15.34*G 3.00 76.43 ±11.43* 144.78 ±16.51*H 4.00 84.84 ±12.43* 150.89 ±20.93*

3.2 體外抗血栓作用

3.2.1 溶栓作用

如表2所示，隨著給藥時間的延長，各實驗組的血栓溶解率也逐漸增大，血栓變得松散，漸漸呈顆粒狀。與對照組相比，濃度為 0.10、0.25mg/ml的低濃度組別無溶血栓作用外，其他各實驗組均有顯著性的溶栓作用，并且，在供試量范圍內樣品濃度為4.00mg/ml時達到最強溶栓作用。

3.2.2 對全血凝塊的溶解作用

與對照組相比，各樣品組在不同的時間點均顯示出較強的溶解全血凝塊的作用，并隨著給藥時間的延長，全血凝塊溶解率也依次增大，在供試品范圍內，濃度為4.00mg/ml時，達到最大全血凝塊溶解率，見表3。

表2 抵當顆粒劑對家兔體外血栓的溶解作用(s，n=10)

表2 抵當顆粒劑對家兔體外血栓的溶解作用(s，n=10)

注:與對照組比較，*P ＜0.01，＊＊P ＜0.05。

4h 12h 24h 48h對照組 16.43 ±1.13 42.03 ±4.36 48.57 ±5.49 56.87 ±6.86組別 血栓溶解率(%)A 17.11 ±1.36 46.24 ±6.01 53.93 ±6.54 67.40 ±7.70 B 19.01 ±2.94 50.29 ±6.93 59.61 ±7.63＊＊ 71.14 ±8.48＊＊C 22.07 ±4.80 55.38 ±8.41* 63.54 ±9.43* 74.35 ±10.22*D 26.08 ±5.64＊＊ 59.05 ±8.30* 68.02 ±11.99* 79.44 ±12.55*E 33.71 ±8.95* 63.08 ±9.33* 72.37 ±10.22* 83.39 ±11.73*F 41.06 ±9.44* 68.33 ±7.51* 78.15 ±9.94* 86.41 ±10.90*G 47.86 ±9.55* 72.39 ±7.64* 82.24 ±8.43* 90.12 ±10.38*H 54.22 ±10.46*79.90 ±8.35* 84.64 ±7.56* 93.19 ±8.67*

表3 抵當顆粒劑對家兔體外全血凝塊的溶解作用(s，n=5)

表3 抵當顆粒劑對家兔體外全血凝塊的溶解作用(s，n=5)

注:與對照組比較，*P ＜0.01，＊＊P ＜0.05。

12h 24h 48h對照組組別 全血凝塊溶解率(%)18.28 ±2.33 26.66 ±5.83 39.73 ±6.93 A 28.59 ±5.57＊＊ 38.07 ±8.19＊＊ 51.44 ±8.00＊＊B 32.03 ±6.43* 45.33 ±8.79* 55.75 ±7.35*C 36.03 ±7.24* 49.71 ±8.32* 60.17 ±7.61*D 41.14 ±8.29* 53.36 ±7.73* 65.98 ±8.32*E 47.04 ±8.89* 58.21 ±7.48* 72.77 ±8.24*F 53.11 ±8.57* 63.41 ±9.34* 77.83 ±9.59*G 58.55 ±10.17* 69.35 ±10.31* 83.68 ±9.58*H 62.63 ±10.37* 77.60 ±11.42* 90.16 ±7.32*

4 討論

本文采用體外抗凝血與抗血栓實驗，檢測抵當顆粒劑對體外抗凝血及抗血栓的作用強度。在抗凝血實驗中，低劑量組抗凝血效果不顯著，隨著劑量的增大，抗凝血效果逐漸明顯，與對照組比較具有顯著性差異;在溶栓作用實驗中，與對照組比較，低劑量組無顯著性差異，隨著時間的延長，逐漸顯現出差異性;隨著劑量的增大，具有明顯的差異性，且隨著時間的延長，溶栓作用越強;在全血凝塊的溶解作用實驗中，抵當顆粒劑各劑量組在不同的時間點均顯示出較強的溶解全血凝塊的作用，與對照組比較，具有顯著性差異。

實驗結果直接表明了抵當顆粒劑在抗凝血與抗血栓方面具有較強的作用，這也間接的證明了抵當顆粒劑在治療凝血或血栓引起的心腦血管疾病方面可能具有顯著的療效。其藥效學關系將在有關動物體內實驗中進一步研究證實。

［1］王付.經方學用解讀［M］.北京:人民軍醫出版社，2004:384.

［2］楊奇云，虞舜.抵當湯臨床應用近況［J］.遼寧中醫藥大學學報，2010，12(5):31 －33.

［3］鐘山，崔征，王東，等.水蛭注射液抗血栓與抗凝血作用［J］.沈陽藥科大學學報，2006，23(7):456 －458.

［4］劉秀文，湯仲明，梁心平，等.重組葡激酶對兔實驗性肺栓塞的溶栓作用［J］.藥學學報，1998，33(11):801 －806.