典型亞熱帶熱分層水庫秋季細菌群落垂直分布

周 菁，余 正，劉開國，田 野，余小青，劉樂冕，張文靜，楊 軍,*

(1. 中國地質大學(武漢)環境學院，武漢 430074；2. 中國科學院城市環境研究所水生態健康研究組，廈門 361021；3. 中國科學院大學，北京 100049；4. 福建省莆田市環境保護局，莆田 351100；5. 廈門大學海洋與地球學院，廈門 361102)

典型亞熱帶熱分層水庫秋季細菌群落垂直分布

周 菁1,2，余 正2, 3，劉開國4，田 野1, 2，余小青2，劉樂冕2，張文靜5，楊 軍2,*

(1. 中國地質大學(武漢)環境學院，武漢 430074；2. 中國科學院城市環境研究所水生態健康研究組，廈門 361021；3. 中國科學院大學，北京 100049；4. 福建省莆田市環境保護局，莆田 351100；5. 廈門大學海洋與地球學院，廈門 361102)

水庫在我國東南沿海地區是重要的飲用水水源地，對地區經濟發展和社會穩定起到重要作用。選擇亞熱帶地區典型的熱分層水庫——福建莆田東圳水庫，于2011年秋季穩定分層期，以水體溫度的垂直變化特征為依據進行分層采樣。應用PCR-DGGE和克隆測序的方法研究浮游細菌群落的垂直分布特征，利用多元統計分析揭示細菌群落與熱分層水體理化指標之間的關系。結果顯示：溶解氧、電導率、葉綠素a、總氮、氨氮及硝氮在上下層水體中的分布有顯著差異，下層缺氧區細菌的Shannon-Wiener指數和DGGE條帶數明顯高于上層好氧區，表明東圳水庫熱分層水體中存在明顯的物理、化學及生物分層現象。測序結果表明β-變形菌可能是東圳水庫中占優勢的細菌類群，統計結果提示溶解氧是顯著影響細菌群落組成的環境因子。熱分層水體的物理化學分層與水體細菌群落結構密切相關，提示水庫生態學研究應對水體熱分層給予重視。

水庫型水源地；熱分層；PCR-DGGE；細菌群落多樣性

水庫是一種介于河流和湖泊間的半人工半自然水體，其生態系統直接受到人類活動調節，具有獨特的生態學特征[1]。近十多年來，由于地下水不足和河流污染日趨嚴重，遠離大城市的水庫逐漸成為重要的飲用水水源，且呈逐年增加的趨勢。水庫生態系統關系到居民飲水健康、社會穩定、以及經濟的可持續發展[2- 3]，特別是擔負著城市飲用水安全的水庫需要更多的監測、評估和研究。生態系統的多樣性和可持續性一直是水環境保護研究的重點[4]。浮游細菌具有分布廣泛，代謝快，對環境變化反應迅速等優點[5]，且與水體質量特別是水體富營養化密切相關，因此受到越來越多的關注和研究[6- 11]。水體理化指標，如水溫、溶解氧、營養鹽等是生命活動的基礎，也是水生態系統的基本參數[12- 14]。因此，研究水庫水體浮游細菌多樣性及其影響因子有利于提高對水庫生態系統的認知水平[15]，可為水庫的評估和管理提供基礎資料和科學依據。以往對水庫型水源地的研究側重于水平尺度評價水庫生態系統的時空變化，而對我國亞熱帶熱分層水庫細菌群落結構特征與變化的研究還遠遠不夠[2]。典型熱分層水庫隨著水體溫度分層的出現，其他物理化學參數也呈現梯度變化，使得不同水層的生境特征差異顯著，這為研究水體浮游細菌的垂直分布規律提供了良好的實驗材料。

東圳水庫是典型亞熱帶分層水庫，位于海峽西岸地區福建省木蘭溪支流延壽溪上，是莆田市唯一一座已建成大型水庫。該水庫于1960年建成，主要用途為灌溉、防洪、發電及生活和工業用水，水庫流域面積321 km2，總庫容4.35億m3，水域面積達17.7 km2，設計正常蓄水位80.5 m，相應庫容2.83億m3，庫區多年平均徑流量3.02億m3[16]。

本研究以水體溫度、溶解氧和葉綠素a垂直變化特征為依據對東圳水庫進行分層采樣，區別于只研究表層或混合水樣的傳統方式。通過在水體表層-好氧區-缺氧區的分層采樣，利用PCR-DGGE和克隆測序的方法，研究不同水層細菌群落組成與多樣性；結合采樣現場和實驗室測定的十項理化指標，分析細菌群落與水體理化指標特別是氮磷營養元素之間的定量關系，進而為水庫型水源地水質優化管理與飲用水安全保障提供科學資料。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與理化指標測定

2011年10月選擇東圳水庫壩前湖泊區進行垂直分層采樣(圖1)。采樣站最大水深為36 m，現場以1 m為間隔測定溫度、溶解氧和葉綠素a濃度，并繪制相應的垂直變化曲線，據此確定采樣深度。本研究共選擇采集5個水層的樣品：0號樣品采集于表層水體；10號、20號樣品采集于溫躍層以上，屬于溶解氧含量較高的好氧區，其對應的水深分別是10 m和20 m；26號、33號樣品采集于溫躍層以下，屬于溶解氧含量低的缺氧區，對應水深分別是26 m和33 m。每個采樣深度取5 L水，并快速運送至實驗室進行分析。

圖1 東圳水庫采樣點示意圖Fig.1 Sampling location in Dongzhen Reservoir

本研究分析測定的環境參數通過現場測定和實驗室測定完成。現場測定采用HACH多參數水質測量儀進行，包括溫度、電導率、pH、溶解氧和葉綠素a；總氮、氨氮、硝氮、總磷及磷酸鹽的測定，則依據國家環保部的標準方法在實驗室進行[17]。

1.2 細菌DNA提取

將水樣搖勻后取1 L，經0.22 μm微孔濾膜過濾，將載有細菌的濾膜保存于-80℃冰箱。取出冰箱中的濾膜，在超凈工作臺中用滅菌的剪刀將其剪碎，裝入滅菌離心管中，按照試劑盒說明書(E.Z.N.ATMSoil DNA Kit，Omega Bio-Tek，USA)進行DNA提取，DNA提純后重懸于80 μL緩沖液中。提取的DNA樣品分裝于小管中，置于-20℃冰箱中保存備用。

1.3 PCR擴增和變性梯度凝膠電泳(DGGE)

為研究細菌群落，選擇16S rDNA通用引物341F(5′-GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′)和907R(5′- CCG TCA ATT CMT TTG AGT TT-3′)作為PCR擴增引物，其中引物341F 的5′末端加上結構為5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC-3′ 的GC鏈[18]。PCR反應體系為50 μL，包括5 μL 10 × Ex PCR緩沖液(10 mmol/L，Mg2+終濃度為1.5 mmol/L)，4 μL dNTP(10 mmol/L)，0.5 μL Ex Taq酶(5 U/μL)，PCR前后引物各1 μL(10 μmol/L)，36.5 μL ddH2O和2 μL DNA模板。PCR反應程序如下：預變性條件為94℃，5 min；35個循環為94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min；最后72℃延伸10 min。

使用美國Bio-Rad公司的Dcode Universal Mutation Detection System 電泳系統進行變性梯度凝膠電泳。本實驗中采用濃度為6%的聚丙烯酰胺，變性劑梯度為35%—55%。電泳緩沖液為1 × TAE，電泳運行設置：恒溫60℃，恒壓100 V，電泳16 h。電泳完畢后，使用SYBR Green I染液染色30 min，經ddH2O沖洗后，在Gel Doc EQ imager(Bio-Rad，USA)成像系統下掃描拍照。

1.4 系統發育分析

從DGGE凝膠上切下清晰、明亮的條帶，置于50 μL ddH2O中4℃過夜。以溶出的DNA作為模板，341F/907R為引物進行PCR擴增，反應條件同1.3。PCR產物純化后連接到pMD18-T載體，隨后轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞中孵育、培養并進行藍白斑篩選。挑取白色克隆進行PCR檢測，將正確插入目的片段的克隆樣品進行測序分析。序列在NCBI數據庫(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中進行比對，查找與其最相似的已知序列以確定其分類歸屬。

1.5 統計分析

利用Quantity One軟件對DGGE圖譜上的條帶進行數字化處理。以每個泳道上條帶有無為標準構建0/1矩陣。利用PRIMER 5.0軟件計算細菌群落物種豐度(條帶數，S)和多樣性指數(Shannon-Wiener指數，H′)；基于Bray-Curtis系數計算各采樣水層間細菌群落組成的相似系數，并進行聚類分析[19]。

利用CANOCO 4.5軟件分析細菌群落與環境因子之間的定量關系。為了顯示環境變量的梯度變化，采用主成分分析(PCA)對理化指標進行分析,除pH外的其他參數均經過ln(x+1)轉換。細菌群落數據的除趨勢對應分析(DCA)結果顯示最大的梯度長度小于3，表明符合線性分布，適合采用冗余分析(RDA)來分析細菌群落與環境因子之間的關系。

1.6 序列登錄號

本研究獲得的細菌16S rDNA序列在GenBank的登錄號為：KC282459-KC282465。

2 結果

2.1 水庫水體理化分層特征

本研究中，采樣站點最大水深為36 m。現場測定結果顯示，水體的溫躍層在水深23—26 m處，溫度由23.44℃驟降至17.03℃；溶解氧急劇變化區在水深23—24 m處，其含量由3.96 mg/L降至0.24 mg/L，水深24 m以下為缺氧區；葉綠素a含量表現為：0—5 m表層水體中，隨著水深增加而增加，水深10—15 m含量有所下降，15—21 m波動上升，而后在溫躍層快速下降至0.2 μg/L左右，并保持平衡；其他指標隨水深亦呈梯度變化，且在溫躍層表現最為顯著。東圳水庫5個采樣水層水體理化參數見表1。總氮、氨氮、硝氮顯示出較明顯的規律性，隨著水深增加，總氮及氨氮含量逐漸增加；硝氮含量則在好氧區0—20 m內的水深較穩定，20—26 m間有一定下降，此后隨著水深增加，呈逐漸降低趨勢。

表1 東圳水庫各采樣水層水體環境參數

圖2 東圳水庫環境因子主成分分析(圓點表示采樣點，數字表示采樣深度)Fig.2 PCA plots of environmental variables from water samples at different depths in Dongzhen Reservoir(Black dots and numbers indicate sampling sites and their water depths, respectively)

主成分分析(PCA)結果顯示，PCA前兩軸累計貢獻率為95.8%，其中第一軸貢獻率為91.2%，綜合了絕大多數信息。對PCA第一軸貢獻率大的因子分別是：溫度(r=-0.9979)、溶解氧(r=-0.9900)、電導率(r=0.9732)、硝氮(r=-0.9571)、氨氮(r=0.9423)、葉綠素a(r=-0.9004)、總氮(r=0.8693)；而對第二軸貢獻率較大的是總磷(r=0.5051)。沿PCA第一軸，5個采樣水層可大致分為2組，第1組包括0 m、10 m和20 m樣品，屬于上層溫度較高的好氧區；第2組為26 m和33 m樣品，屬于下層低溫的缺氧區(圖2)。

2.2 細菌群落組成與多樣性

DGGE指紋圖譜(圖3)共顯示出45個不同的條帶，其中19個條帶在5個樣品中均有出現，占總條帶數的42%；8個條帶為單個水層特有，占總條帶數的18%，其中2個條帶僅在0 m出現，1個條帶僅在10 m出現，3個條帶僅在26 m出現，而2個條帶僅在33 m水層處出現。5個采樣水層的DGGE條帶數平均值為30.6，其中，20 m處最低，為25；26 m處最高，為38。Shannon-Wiener指數均值3.409，20 m水層最小，為3.219；26 m水層最大，為3.638。DGGE條帶數和Shannon-Wiener指數均呈現底層(26—33 m)顯著高于表層(0-20 m)的特征(圖4)。

圖3 16S rDNA的DGGE指紋圖譜及切膠示意圖Fig.3 The 16S rDNA fingerprinting of bacterial communities by PCR-DGGE. Bands indicated with an arrow head were excised and sequenced

圖4 東圳水庫細菌群落DGGE條帶數和Shannon-Wiener指數垂直分布Fig.4 Vertical distribution of DGGE band number and Shannon-Wiener index of bacterial community in Dongzhen Reservoir

基于Bray-Curtis相似性系數的聚類分析中，當相似度為74.0%時，5個水層被劃分為兩組：第1組由上層溫度較高，硝氮含量較高的好氧區水體0、10 m和20 m樣品組成；第2組是由底層溫度較低，氨氮含量較高的缺氧區樣品組成，即26 m和33 m樣品(圖5)。

圖5 東圳水庫細菌群落聚類分析Fig.5 Cluster analysis of bacterial community based on Bray-Curtis similarity in Dongzhen Reservoir

對DGGE優勢條帶測序分析，成功獲得7條序列(圖3, 表2)，均為5個采樣水層所共有。同NCBI數據庫比對分析發現，絕大多數與不可培養的細菌序列相似性較高。系統發育分析表明，其中4條序列屬于β-變形菌(Betaproteobacteria)，1條序列屬于α-變形菌(Alphaproteobacteria)，2條序列屬于放線菌(Actinobacteria)。

2.3 細菌群落與環境因子的關系

冗余分析(RDA)結果顯示，10個環境因子共同解釋了74.3%的細菌群落組成變化，僅溶解氧與第一排序軸呈顯著的相關關系(P< 0.01)，其余9個環境因子與細菌群落相關性不顯著(圖6)。在RDA的前4個排序軸中，第一軸的特征值最大(0.576)，因此，環境因子沿第一軸的變化對浮游細菌的分布影響最大，而且溶解氧是最顯著的環境因子。沿第一軸，上層好氧區水體0 m、10 m和20 m位于RDA雙序圖左側，而底層缺氧區26 m和33 m位于右側。

表2 DGGE測序條帶序列系統發育分析

圖6 東圳水庫細菌群落與環境因子的RDA排序圖Fig.6 RDA ordination showing the bacterial community composition in Dongzhen Reservoir in relation to the environmental factors**表示P < 0.01

3 討論

3.1 水庫熱分層的形成及其對水環境的影響

深水湖泊與水庫的水環境和水體季節性熱分層緊密聯系[20- 21]。典型的亞熱帶深水水庫中，夏秋季節上層水體溫度明顯高于下層水體，由于水體的熱能傳輸不均勻，冷、熱水體密度的差異導致水體的物理分層，進而導致不同水層之間化學性質也產生差異，同時表現在水體溶解氧在溫躍層的劇烈變化。東圳水庫位于亞熱帶季風氣候區，水溫常年在15℃以上，本次秋季采樣研究中，表層水溫為23.90℃，底層水溫為15.06℃，在水深23—26 m處，水溫由23.44℃驟降至17.03℃。因此，上層水體溫度較高，浮游植物光合作用加強，產生的氧氣釋放到水體，使上層水體溶解氧濃度升高，甚至過飽和；而在下層水體中，則可能發生與此相反的過程，在下層水體和沉積物中的細菌分解有機質以及浮游生物遺體等，消耗水體中溶解氧，致使溶解氧濃度下降，進而形成缺氧環境。而熱分層結構的形成和維持穩定限制了水體的垂直交換，其強度足以阻斷上層水體向下層水體的耗氧補償[22]。這也從本研究中上、下層水體溶解氧的顯著變化得到了印證，在水深23—24 m處，溶解氧由3.96 mg/L降至0.24 mg/L，由好氧環境躍變為缺氧環境。此外，綜合環境變量的主成分分析(PCA)結果也證明，東圳水庫水體熱分層使上下不同水層具有多樣的水環境，這勢必將影響水庫內水化學(如氧化-還原變化)、物質地球化學循環，甚至導致水體浮游生物群落結構在不同水層之間存在顯著的差異[20]。

水體的季節性熱分層對湖泊水庫氮、磷等營養元素的循環轉化過程都起著關鍵性控制或影響作用[23- 24]。東圳水庫的研究表明，隨著水深的增加，總氮和氨氮的含量呈升高趨勢，而硝氮的含量在好氧區比較穩定，在缺氧區顯著降低，預示著在缺氧區，可能存在強烈的反硝化作用，將硝態氮還原。磷酸鹽則呈現交替變化現象，總的趨勢是底層缺氧區磷酸鹽含量要高于上層好氧區，這也支持Carpenter的研究模型[21]。大型湖泊或者水庫底部有大量富含磷酸鹽的沉積物，在氧化環境下沉積物/水界面形成的鐵、錳氧化物會吸附、沉淀可溶性磷酸鹽，進而降低磷的釋放量[25- 26]；但當底層水體含氧量低時，鐵、錳和其他重金屬元素被還原[27]，磷酸鹽釋放進入水體導致水體富營水平升高。來自沉積物的內源磷釋放也很好的解釋了當外源的磷被有效控制后，水體富營養化狀態并沒有立即得到改善[28- 29]。

3.2 熱分層對浮游細菌群落的影響

3.3 應加強水庫熱分層現象的研究

近百年來，世界各地所建水庫的貯水量在內陸水體中占有相當的比重。水庫的熱量、溶解氧和營養物收支依其排水方式而異。分層水庫中，大壩的表層出水或者深層出水對下游河流都有很大的影響。表層放水可以使得大量的浮游生物、營養鹽和漂浮植物隨水流進入下游河流進而對下游河流產生影響；而深層放水，特別是當水庫底層水在缺氧條件下產生有毒的硫化氫時，將會對下游生物群落產生更顯著的負面影響[34]。王雨春等[22]在百花湖水庫的研究表明，西南地區深水水庫，在夏季會出現一定的水體熱分層現象，并導致顯著的水體水化學如溶解氧分層，進而影響水庫水環境質量，而近年來百花湖水庫時有發生的季節性水質惡化事件，則是由于秋季溫度突然降低引起的水體分層結構失穩，上下水團在垂直交替過程中耗氧和復氧機制不平衡所致。夏品華等[35]對紅楓湖水庫的研究也發現突發性水質惡化與水體分層失穩有關，在初秋季節，由于氣溫的驟變，上下層水體發生等溫對流，下層富集的還原物質及營養鹽向上遷移，還原物質氧化消耗水中溶解氧，使水體缺氧，在缺氧和H2S等有毒物質的作用下，容易發生水質惡化事件，出現魚蝦等水生生物死亡的現象。浮游細菌作為水庫生物群落中的關鍵與優勢類群，對水體環境變化十分敏感[7- 10]。本研究表明，浮游細菌的群落結構具有明顯的垂直分布特征，特別是在亞熱帶熱分層水庫的上層和下層水體間存在顯著差異，提示我們在對分層水庫的研究中不應只研究表層水體。研究季節性熱分層水庫細菌群落結構與環境因子變化的關系可能是解答富營養化過程和機理的關鍵之一，而溶解氧在今后的研究中也應引起足夠的重視。這些都將為水庫富營養化治理、藍藻藻類水華防控、水質優化管理等提供基礎資料和科學依據。

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Bacterial community and its relation to environmental variables in a subtropical stratified reservoir for drinking water supply in autumn

ZHOU Jing1, 2，YU Zheng2,3，LIU Kaiguo4， TIAN Ye1, 2，YU Xiaoqing2，LIU Lemian2，ZHANG Wenjing5，YANG Jun2,*

1SchoolofEnvironmentalStudies,ChinaUniversityofGeosciences(Wuhan),Wuhan430074,China2AquaticEcoHealthGroup,InstituteofUrbanEnvironment,ChineseAcademyofSciences,Xiamen361021,China3UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China4EnvironmentalProtectionBureauofPutianCity,Putian351100,China5CollegeofOceanandEarthSciences,XiamenUniversity,Xiamen361102,China

Fujian reservoirs in southeast China are important water resources for economic and social sustainable development, although few have been studied previously. Dongzhen Reservoir, a typical subtropical stratified reservoir in Fujian, was chosen for investigation of bacterial distribution, composition and diversity in autumn 2011. As the only built large reservoir in Putian City, it plays an important role in irrigation, flood control, hydroelectric power, and water supply. Dongzhen Reservoir shows an obvious phenomenon of water thermal stratification during summer and autumn, thus creates a unique gradient of environmental variables along the water column. We investigated the bacterial community and its relation to environmental variables in this study for a better understanding of vertical distribution of bacterial community and the primary environmental drivers in a stratified reservoir. Five water samples were collected from five different depths according to the vertical changes of temperature. Both PCR-DGGE and sequencing were used to investigate the bacterial community and diversity. Moreover, physical and chemical parameters were measured according to the national standard methods. Multivariate statistical techniques were used to examine the relationship between bacterial community and environmental variables. Principal component analysis (PCA) clearly showed that water temperature, dissolved oxygen (DO), chlorophyll a (Chl a), total nitrogen (TN), ammonia nitrogen (NH4-N), nitrite/nitrate nitrogen (NOx-N) and electric conductivity of the upper aerobic zone were differed from those of the deeper anoxic zone. Both the number of DGGE bands and the Shannon-Wiener index of the deeper anoxic zone were higher than those of the upper aerobic zone. Further, two groups were distinguished by the cluster analysis of bacterial communities based on the Bray-Curtis similarity. Thus, Dongzhen Reservoir presented an obviously physical, chemical, and biological stratified phenomenon. Seven bands that common to all sampling depths were extracted and sequenced, and among which four were identified as Betaproteobacteria, indicating that Betaproteobacteria were the most dominant taxa in Dongzhen Reservoir in autumn. Bacterial community composition and diversity differed greatly among different sampling depths, and these differences were closely related to the physical and chemical stratification of the water body. Redundancy analysis (RDA) demonstrated DO was the significant environmental variable that shaping the bacterial community and diversity (P< 0.01). Therefore, we should pay more attention to DO and thermal stratification of reservoirs for sustainable reservoir management.

reservoir for drinking water supply; thermal stratification; PCR-DGGE; bacterial diversity

國家重大科學研究計劃(2012CB956103); 中國科學院知識創新工程方向項目(KZCX2-YW-QN401); 國家自然科學基金面上項目(31172114); 福建省杰出青年科學基金項目(2012J06009)

2013- 02- 03; 網絡出版日期:2014- 03- 13

10.5846/stxb201302030226

*通訊作者Corresponding author.E-mail: jyang@iue.ac.cn

周菁，余正，劉開國，田野，余小青，劉樂冕，張文靜，楊軍.典型亞熱帶熱分層水庫秋季細菌群落垂直分布.生態學報,2014,34(21):6205- 6213.

Zhou J，Yu Z，Liu K G， Tian Y，Yu X Q，Liu L M，Zhang W J，Yang J.Bacterial community and its relation to environmental variables in a subtropical stratified reservoir for drinking water supply in autumn.Acta Ecologica Sinica,2014,34(21):6205- 6213.