微藻光密度與細(xì)胞密度及生物質(zhì)的關(guān)系

梁 芳，鴨 喬，杜偉春，溫曉斌，耿亞洪，李夜光,*

(1. 中國(guó)科學(xué)院武漢植物園植物種質(zhì)創(chuàng)新與特色農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049 3. 云南施普瑞生物工程有限公司，昆明 650106)

微藻光密度與細(xì)胞密度及生物質(zhì)的關(guān)系

梁 芳1,2，鴨 喬3，杜偉春3，溫曉斌1,2，耿亞洪1，李夜光1,*

(1. 中國(guó)科學(xué)院武漢植物園植物種質(zhì)創(chuàng)新與特色農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049 3. 云南施普瑞生物工程有限公司，昆明 650106)

以四種常見(jiàn)微藻，小球藻(Chlorellasp. XQ- 20044)、柵藻(Scenedesmussp. SS- 200716)、綠球藻(Chlorococcumsp.)和螺旋藻(Spirulinasp. CH- 164)為實(shí)驗(yàn)材料，用梯度稀釋法測(cè)定對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期不同濃度藻液的光密度(OD)、細(xì)胞密度和生物質(zhì)干重(DW)，在光自養(yǎng)分批培養(yǎng)模式下對(duì)4種微藻進(jìn)行OD-波長(zhǎng)(350—800 nm)掃描，同時(shí)測(cè)定細(xì)胞密度和生物質(zhì)干重，分析藻液OD與細(xì)胞密度、生物質(zhì)干重的關(guān)系。結(jié)果表明：在任何波長(zhǎng)下，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4種微藻細(xì)胞密度與OD值、生物質(zhì)干重與OD值的變化都不成比例，波長(zhǎng)不同其擬合曲線(xiàn)偏離直線(xiàn)的程度不同。但是，在435 nm處這種關(guān)系最接近直線(xiàn)，可以用直線(xiàn)方程近似描述(R2> 0.98)，其它波長(zhǎng)處細(xì)胞密度-OD、干重-OD的關(guān)系都可以用二項(xiàng)式方程很好地描述(R2> 0.99)。因此，光密度法適用于連續(xù)和半連續(xù)培養(yǎng)，可以用435 nm處測(cè)得的OD值計(jì)算細(xì)胞密度與干重。但是在分批培養(yǎng)模式下，4種微藻DW/OD比值隨著培養(yǎng)時(shí)間均逐漸上升。小球藻DW/OD540為0.19—0.44 g/L，柵藻DW/OD540為0.36—0.53 g/L，綠球藻DW/OD540為0.48—0.75 g/L，螺旋藻DW/OD560為0.46—0.74 g/L，因此分批培養(yǎng)模式下采用測(cè)定藻液OD值反映細(xì)胞密度和生物質(zhì)的方法不適用，只有直接測(cè)定細(xì)胞密度和生物質(zhì)才是準(zhǔn)確的。研究結(jié)果為正確使用分光光度法監(jiān)測(cè)微藻生長(zhǎng)提供依據(jù)。

微藻;光密度;細(xì)胞密度;干重

微藻是一種遍布全球水體的低等浮游植物，是水體中原初生產(chǎn)力的主要組成部分，由于富含蛋白質(zhì)、人體必需氨基酸、高不飽和脂肪酸、色素及多種生物活性物質(zhì)，而成為現(xiàn)代社會(huì)食品、醫(yī)藥、飼料和燃料等的重要來(lái)源。目前，世界上商業(yè)化生產(chǎn)的微藻主要有螺旋藻(Spirulina)、小球藻(Chlorella)、紅球藻(Haematococcus)和杜氏藻(Dunaliella)等[1- 4]。螺旋藻具有增強(qiáng)人體免疫力、抗疲勞、改善消化系統(tǒng)功能等作用，因而作為保健食品和藥品被大規(guī)模生產(chǎn)[5]。小球藻含有高達(dá)50%的粗蛋白和人體必需氨基酸，既是一種優(yōu)良的保健品，也被用做珍貴動(dòng)物的餌料添加劑[6]。成熟的紅球藻孢子中蝦青素(Astaxanthin)含量可高達(dá)1%—3%，蝦青素是一種類(lèi)胡蘿卜素，具有超強(qiáng)的抗氧化活性，可作為保健品和高檔化妝品的有效成分，也是三文魚(yú)等珍貴水產(chǎn)品養(yǎng)殖必不可少的飼料添加劑[7]。杜氏藻含有大量的β-胡蘿卜素和甘油，前者是維生素A的前體物質(zhì)，也是一種天然抗氧化劑，后者是重要的有機(jī)化工原料[8]。

在微藻的培養(yǎng)過(guò)程中，無(wú)論是室內(nèi)的研究還是室外的大規(guī)模養(yǎng)殖，都需要不斷地檢測(cè)其生長(zhǎng)狀況，掌握細(xì)胞密度和生物質(zhì)的變化。細(xì)胞密度可以通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法測(cè)定[9]，生物質(zhì)可以通過(guò)稱(chēng)重法測(cè)定[10- 11]。由于細(xì)胞計(jì)數(shù)法和稱(chēng)重法操作都比較繁瑣、耗時(shí)耗力，目前無(wú)論在微藻研究的實(shí)驗(yàn)室還是生產(chǎn)工廠(chǎng)，都普遍采用一種便捷、省時(shí)的方法—利用分光光度計(jì)測(cè)定藻液光密度(OD)來(lái)間接反映細(xì)胞密度和生物質(zhì)干重[12- 13]。光密度法也廣泛應(yīng)用于微生物生長(zhǎng)的測(cè)定[14- 15]。測(cè)定光密度采用的波長(zhǎng)依微藻種類(lèi)的不同而異，主要有500、540、560、680、730 nm和750 nm，甚至對(duì)于同一種微藻也使用幾種不同的測(cè)定波長(zhǎng)。不少文獻(xiàn)描述微藻的干重或細(xì)胞密度與光密度成直線(xiàn)關(guān)系：Hsieh和Fan等報(bào)道了小球藻的干重與藻液OD值呈直線(xiàn)關(guān)系[16- 17]。沈萍萍研究了15種微藻，結(jié)果顯示在680 nm處細(xì)胞密度與藻液OD值呈直線(xiàn)關(guān)系[18]。黃美玲的報(bào)道顯示，在OD680<0.5時(shí)，小球藻的干重與藻液OD值呈直線(xiàn)關(guān)系，細(xì)胞密度與OD也呈直線(xiàn)關(guān)系[13]。Liu等報(bào)道了小球藻在500 nm處的OD與細(xì)胞密度呈直線(xiàn)關(guān)系[9]。但是，也有不同的報(bào)道：劉學(xué)銘等研究了分批異養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中小球藻在540 nm處的光密度值與干重的關(guān)系，結(jié)果表明干重與OD的比值受培養(yǎng)條件和培養(yǎng)過(guò)程的影響很大，DW/OD先升后降，變化范圍0.53—0.28[19]。

研究發(fā)現(xiàn)，在多數(shù)微藻培養(yǎng)后期，藻液OD值達(dá)到基本穩(wěn)定時(shí)，生物質(zhì)(干重)持續(xù)增長(zhǎng)，同時(shí)細(xì)胞密度卻在下降或基本不變。在此情況下，如果利用OD值的變化表示細(xì)胞密度或生物質(zhì)變化就會(huì)產(chǎn)生很大誤差。微藻培養(yǎng)過(guò)程中，藻液OD變化與細(xì)胞密度、生物質(zhì)變化是什么關(guān)系，這種關(guān)系是否受測(cè)定波長(zhǎng)的影響？利用分光光度計(jì)測(cè)定藻液OD值變化間接反映細(xì)胞密度和生物質(zhì)干重變化的方法是否適用？其適用性是否受微藻種類(lèi)和培養(yǎng)模式(分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和半連續(xù)培養(yǎng))的影響？為了尋找以上問(wèn)題的答案，本文選用大小、形態(tài)不同的4種微藻，通過(guò)梯度稀釋法測(cè)定不同濃度藻液的OD值與細(xì)胞密度及生物質(zhì)干重，在分批培養(yǎng)過(guò)程中測(cè)定4種微藻藻液的可見(jiàn)光吸收光譜，同時(shí)測(cè)定細(xì)胞密度和生物質(zhì)干重，研究光密度與細(xì)胞密度、生物質(zhì)的關(guān)系。研究結(jié)果為正確使用分光光度法監(jiān)測(cè)微藻生長(zhǎng)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種

本實(shí)驗(yàn)采用4種微藻：小球藻(Chlorellasp. XQ- 20044)、柵藻(Scenedesmussp. SS- 200716)、綠球藻(Chlorococcumsp.)和螺旋藻(Spirulinasp. CH- 164)，均由中國(guó)科學(xué)院武漢植物園經(jīng)濟(jì)微藻藻種庫(kù)提供，四種微藻的形態(tài)分類(lèi)特征見(jiàn)表1。螺旋藻是多細(xì)胞絲狀藍(lán)藻，藻體最大；柵藻是多細(xì)胞綠藻(藻體通常由4個(gè)細(xì)胞組成)；綠球藻和小球藻都是單細(xì)胞綠藻，小球藻藻體最小。4種藻代表大小、形狀不同的多細(xì)胞和單細(xì)胞微藻。

表1 微藻的形態(tài)特征

1.2 培養(yǎng)方法

3種綠藻均采用改良的BG- 11培養(yǎng)基[20]，螺旋藻采用Zarrouk培養(yǎng)基，其中NaNO3濃度改為0.1 g/L。本實(shí)驗(yàn)采用通氣培養(yǎng)裝置進(jìn)行培養(yǎng)，該裝置主要由長(zhǎng)方體水槽、300 mL玻璃培養(yǎng)管、側(cè)面平行排列的10只40W日光燈管、控溫系統(tǒng)、水循環(huán)系統(tǒng)、充氣系統(tǒng)和CO2供給系統(tǒng)等組成[21]。

取旺盛生長(zhǎng)的微藻，3500 r/min離心8 min收集藻細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基清洗后，再次離心收集藻細(xì)胞，接種于新鮮培養(yǎng)基中，進(jìn)行通氣培養(yǎng)。每種微藻接種3個(gè)培養(yǎng)管，每管裝200 mL藻液。培養(yǎng)開(kāi)始后的前24 h光照強(qiáng)度為100 μmol m-2s-1，之后光照強(qiáng)度提高為200 μmol m-2s-1。培養(yǎng)溫度保持為(30±0.5)℃，光暗周期為14/10 h。4種微藻均在培養(yǎng)的第0、2、4、6、7、8天取樣，每次取樣后在培養(yǎng)管外壁準(zhǔn)確標(biāo)出藻液液面位置，下次取樣之前先補(bǔ)加滅菌水至標(biāo)記處，以補(bǔ)充培養(yǎng)過(guò)程中蒸發(fā)掉的水分。每隔24 h向藻液中充入CO2，將螺旋藻藻液的pH降至9.5左右，其它3種綠藻的pH值降至7.0左右。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。

1.3 藻液OD值測(cè)定

取藻液3 mL，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV 5800，上海元析)1 cm光徑比色杯，進(jìn)行OD-波長(zhǎng)掃描。波長(zhǎng)范圍350—800 nm，波長(zhǎng)間隔為5 nm，獲得不同波長(zhǎng)下的OD值。

1.4 藻液細(xì)胞密度的測(cè)定

細(xì)胞計(jì)數(shù)：向3種綠藻藻液(每個(gè)樣品2 mL)中分別加入Logul固定液0.05 mL，在顯微鏡下用血球細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)3次，計(jì)算出細(xì)胞密度平均值。當(dāng)藻液密度過(guò)大無(wú)法計(jì)數(shù)時(shí)，可將藻液精確稀釋后進(jìn)行計(jì)數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)即得到原藻液細(xì)胞密度。小球藻和綠球藻是單細(xì)胞微藻，直接計(jì)算個(gè)體數(shù)；柵藻雖然是多細(xì)胞個(gè)體，但是在通氣培養(yǎng)條件下分散成單細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)目以單個(gè)細(xì)胞數(shù)計(jì)算。正在分裂的細(xì)胞若子細(xì)胞清晰可見(jiàn)則均需計(jì)數(shù)，螺旋藻不計(jì)數(shù)。

1.5 藻液生物質(zhì)干重的測(cè)定

準(zhǔn)確量取藻液體積，用事先干燥并已稱(chēng)重的孔徑為0.45 μm的玻璃纖維膜過(guò)濾收獲藻細(xì)胞，用蒸餾水洗兩次后，放入真空干燥器中干燥至恒重。根據(jù)干藻重量和藻液體積計(jì)算出1 L藻液中的生物質(zhì)干重(g/L)。為了減少實(shí)驗(yàn)誤差，培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)至少取20 mL藻液，第2、4天取10 mL藻液，第6、7、8天取5 mL藻液。

1.6 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻液OD值、細(xì)胞密度和干重的測(cè)定及其關(guān)系分析

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4種微藻，先用3500 r/min離心8 min濃縮獲得高濃度的藻液(OD680≈2.5)，測(cè)定生物質(zhì)干重及細(xì)胞數(shù)目。然后再準(zhǔn)確地將濃縮藻液進(jìn)行稀釋?zhuān)沟玫降脑逡簼舛确謩e為濃縮藻液濃度的1/2、1/4、1/6、1/8、1/10、1/20，對(duì)各個(gè)不同濃度的藻液進(jìn)行OD-波長(zhǎng)掃描。根據(jù)濃縮藻液的干重、細(xì)胞密度和稀釋倍數(shù)，計(jì)算稀釋藻液的干重和細(xì)胞密度，分析藻液OD值與細(xì)胞密度、干重的關(guān)系。

1.7 分批培養(yǎng)過(guò)程中藻液OD值、細(xì)胞密度和干重的測(cè)定及其關(guān)系分析

對(duì)4種微藻進(jìn)行分批培養(yǎng)，于培養(yǎng)的第0、2、4、6、7、8天取樣，進(jìn)行OD-波長(zhǎng)掃描、細(xì)胞計(jì)數(shù)和測(cè)定干重，分析藻液OD值與細(xì)胞密度、干重的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液光密度與生物質(zhì)干重、細(xì)胞密度的關(guān)系

以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的生物質(zhì)干重為縱坐標(biāo)作圖(圖1)。各種波長(zhǎng)下，4種微藻的干重與OD值都不是直線(xiàn)關(guān)系。當(dāng)波長(zhǎng)在435 nm時(shí)，可以用直線(xiàn)方程近似描述(R2>0.98)，具有較高的線(xiàn)性擬合度。4種微藻在435 nm處生物質(zhì)干重(y，g/L)與OD值(x)的直線(xiàn)方程如下：

小球藻y=0.1656x(R2=0.9832)

柵藻y=0.1799x(R2=0.9848)

綠球藻y=0.3686x(R2=0.9989)

螺旋藻y=0.3239x(R2=0.9986)

除了435 nm，其它波長(zhǎng)下OD值與干重的關(guān)系都遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離直線(xiàn)關(guān)系。但是，無(wú)論哪種波長(zhǎng)下，這種關(guān)系都可以很好地用二項(xiàng)式方程描述(R2>0.99)。

三種綠藻細(xì)胞密度-OD值曲線(xiàn)圖與干重-OD值曲線(xiàn)圖相同(圖未顯示)。波長(zhǎng)435 nm時(shí)，細(xì)胞密度與OD值的關(guān)系接近直線(xiàn)，可以用直線(xiàn)方程近似描述。3種綠藻細(xì)胞密度(y，107個(gè)/mL)與OD值(x)的直線(xiàn)方程如下：

小球藻y=1.747x(R2=0.9832)

柵藻y=0.8369x(R2=0.9848)

綠球藻y=1.5204x(R2=0.9989)

與干重-OD關(guān)系一樣，無(wú)論哪種波長(zhǎng)下，細(xì)胞密度與OD值的關(guān)系都可以很好地用二項(xiàng)式方程描述(R2>0.99)。

圖1 不同波長(zhǎng)下干重與OD值的關(guān)系Fig.1 The relationships between biomass dry weight and optical density at different wavelength

2.2 分批培養(yǎng)過(guò)程中藻液OD值、細(xì)胞密度及干重的變化

2.2.1 4種微藻藻液吸收光譜

4種微藻分批培養(yǎng)過(guò)程中不同培養(yǎng)時(shí)間的藻液吸收光譜如圖2所示。觀察對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(培養(yǎng)第2—4天)藻液的吸收光譜，發(fā)現(xiàn)4種微藻光密度的兩個(gè)最大吸收峰都在435—440 nm和670—680 nm處，是微藻細(xì)胞內(nèi)所含色素(主要是葉綠素)的兩處最大吸收波長(zhǎng)。這兩處的光密度值在培養(yǎng)末期相對(duì)降低，不再是最大值，這與生長(zhǎng)后期細(xì)胞內(nèi)的色素變化有關(guān)。在培養(yǎng)后期小球藻的OD值稍有上升，柵藻和螺旋藻基本保持不變或略有下降，綠球藻OD明顯下降。

圖2 4種微藻不同培養(yǎng)時(shí)間藻液的吸收光譜(曲線(xiàn)左端數(shù)字表示培養(yǎng)時(shí)間(d))Fig.2 Optical spectrum of the four microalgae at different culture time (The numbers on the left of curves indicate culture time (d))

2.2.2 4種藻液OD值、細(xì)胞密度及干重的變化

利用OD-波長(zhǎng)掃描獲得的數(shù)據(jù)及對(duì)應(yīng)的細(xì)胞密度和干重，對(duì)4種微藻分批培養(yǎng)過(guò)程中不同波長(zhǎng)下OD值與干重、細(xì)胞密度的關(guān)系進(jìn)行作圖分析(圖未顯示)。結(jié)果表明分批培養(yǎng)模式下無(wú)論哪種波長(zhǎng)，OD值與細(xì)胞密度、干重都不呈直線(xiàn)關(guān)系，也不存在其它有規(guī)律的數(shù)量關(guān)系。因此，僅以慣用波長(zhǎng)(綠藻為540 nm，螺旋藻560 nm)為例，對(duì)4種微藻光自養(yǎng)分批培養(yǎng)過(guò)程中藻液OD值、細(xì)胞密度和生物質(zhì)干重的變化進(jìn)行分析(表2)。

小球藻的OD值隨著培養(yǎng)時(shí)間不斷增大，第6天進(jìn)入穩(wěn)定期，第8天達(dá)到最大為2.067。柵藻的OD值在培養(yǎng)的前7d不斷增大，第7天達(dá)到最大為1.481，第8天基本保持不變。綠球藻和螺旋藻第7天OD值達(dá)到最大，分別為1.944和1.995，第8天稍有下降。

小球藻在接種48h后細(xì)胞密度約增加了4.4倍，之后增加較緩慢。到培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，增加到接種時(shí)的5.6倍。柵藻在接種48h后細(xì)胞密度增加了1.8倍，第6天達(dá)到最大值，為接種時(shí)的3.3倍，第8天細(xì)胞密度下降14%。綠球藻在接種后第4天細(xì)胞密度進(jìn)入穩(wěn)定期，比接種時(shí)增加了1.4倍，之后增加緩慢，第8天細(xì)胞密度下降6%。

小球藻在前4d干重急劇增加，接種48h后干重增加了2.5倍，從第6天開(kāi)始增加較緩慢，到培養(yǎng)結(jié)束時(shí)生物量增加了8.7倍。柵藻在培養(yǎng)的第2天干重增加1.8倍，之后持續(xù)增加到接種時(shí)的4.6倍。綠球藻在前6d生物質(zhì)增加較快，之后減慢，到第8天生物量增加了5倍。螺旋藻在接種2d后生物質(zhì)增加3.5倍，從第6天開(kāi)始基本不再增加，到培養(yǎng)結(jié)束時(shí)生物量增加了5.6倍。

2.2.3 藻液OD值與干重、細(xì)胞密度的關(guān)系

以第0、2、4、6、7、8天測(cè)得的OD值為橫坐標(biāo)，作OD與細(xì)胞密度、干重的關(guān)系曲線(xiàn)(圖3)。在分批培養(yǎng)的前期和中期，3種綠藻的OD值、細(xì)胞密度和干重以及螺旋藻的OD值與干重都呈現(xiàn)一種增長(zhǎng)的趨勢(shì)，但是在培養(yǎng)后期，OD值、細(xì)胞密度和干重的變化趨勢(shì)不一致。干重都保持增長(zhǎng)，而柵藻和綠球藻的細(xì)胞密度均有不同程度的下降，OD值則有各種變化：維持不變，稍有增長(zhǎng)或稍有下降。3種綠藻在培養(yǎng)過(guò)程中DW/OD比值均逐漸上升，小球藻DW/OD比值范圍為0.19—0.44 g/L，柵藻為0.36—0.53 g/L，綠球藻為0.48—0.75 g/L。可見(jiàn)，對(duì)于同一種微藻，隨著培養(yǎng)時(shí)間DW/OD不斷增大；對(duì)于不同種微藻，細(xì)胞越大，DW/OD比值越大。螺旋藻在分批培養(yǎng)過(guò)程中，DW/OD為0.46—0.74 g/L。

表2 分批培養(yǎng)過(guò)程中OD值、細(xì)胞密度和干重的變化

圖3 4種微藻干重、細(xì)胞密度與光密度的關(guān)系Fig.3 The relationships between biomass dry weight, cell density and optical density of microalgaOD540：在波長(zhǎng)為540 nm下藻液的光密度值；OD560：在波長(zhǎng)為560 nm下藻液的光密度值

3 討論

分光光度計(jì)的工作原理是朗伯-比爾定律，即物質(zhì)在一定波長(zhǎng)處的光密度與物質(zhì)的濃度和光程呈正比。微藻藻液是由培養(yǎng)基和懸浮于其中的藻細(xì)胞組成，是一種懸濁液，不僅對(duì)入射光有吸收，還有反射、折射和散射[22]，不符合朗伯-比爾定律成立的條件。因此，利用分光光度計(jì)測(cè)定藻液的光密度，無(wú)論哪種波長(zhǎng)，藻液OD值與細(xì)胞密度，OD值與生物質(zhì)干重都不是嚴(yán)格地按比例變化。

光密度法用于細(xì)胞濃度的測(cè)定最初應(yīng)用于細(xì)菌的生長(zhǎng)中，在一定濃度范圍內(nèi)，細(xì)菌濃度與光密度成正比，此時(shí)可以用光密度來(lái)表征生長(zhǎng)量。早在1949年Monod就提出用光密度法測(cè)定細(xì)菌的生物量，該法較其它方法簡(jiǎn)便易行且有效[23]。后來(lái)，此方法除了用于細(xì)菌及單細(xì)胞微生物外，在微藻的培養(yǎng)中也得到廣泛應(yīng)用。但是，細(xì)胞懸濁液對(duì)光的吸收除了直接與生物量或細(xì)胞密度有關(guān)，還與細(xì)胞的大小、形狀及折射率有關(guān)。當(dāng)細(xì)胞形態(tài)及組成發(fā)生改變時(shí)，對(duì)光的吸收特性也會(huì)隨之改變。由于在最大吸收峰處的信號(hào)最靈敏，因而此處的波長(zhǎng)被廣泛用來(lái)測(cè)定光密度。但是對(duì)于含有細(xì)胞色素的微藻而言，色素本身還具有吸光性，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)色素含量發(fā)生變化時(shí)，就會(huì)干擾結(jié)果的測(cè)定，使測(cè)量值與實(shí)際值產(chǎn)生較大誤差[24- 25]。在分批培養(yǎng)條件下，微藻細(xì)胞色素含量占細(xì)胞干重的比例變化范圍為0.5%—5.5%，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到的生物量干重與實(shí)際測(cè)得值在680 nm處誤差為9%—18%，在750 nm處為5%—13%。因此Griffiths指出，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)色素含量發(fā)生改變時(shí)光密度法是不準(zhǔn)確的[24]。

圖1顯示，梯度稀釋實(shí)驗(yàn)中在波長(zhǎng)435 nm處干重與OD值的關(guān)系最接近直線(xiàn)(OD值范圍0.1—2.7)。對(duì)于其它波長(zhǎng)，只有在藻液濃度很小的范圍內(nèi)，干重與OD值才接近直線(xiàn)關(guān)系。這與已有的一些報(bào)道相似，如郝聚敏報(bào)道蛋白核小球藻在680 nm處OD在0.07—0.12時(shí)，細(xì)胞濃度與OD呈直線(xiàn)關(guān)系，OD在0.04—0.4時(shí)，單位干重與OD呈直線(xiàn)關(guān)系；鈍頂螺旋藻在560 nm處OD在0.1—0.3時(shí)，干重與OD呈直線(xiàn)關(guān)系[26]。王英娟報(bào)道蛋白核小球藻在517 nm處OD在0.05—0.54之間，干重與OD呈直線(xiàn)關(guān)系[12]。這些報(bào)道中藻液的OD值都很低，其適用性受到很大的限制。

梯度稀釋實(shí)驗(yàn)使用的是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液，其特征是細(xì)胞處于旺盛的分裂生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞狀態(tài)和形態(tài)基本一致。只有在這種情況下，干重、細(xì)胞密度與在435 nm處測(cè)得的OD的關(guān)系可以用直線(xiàn)方程描述。連續(xù)或半連續(xù)模式下培養(yǎng)微藻，藻細(xì)胞快速分裂增殖，細(xì)胞的狀態(tài)和形態(tài)也基本一致，可以在435 nm處測(cè)定光密度，利用比例關(guān)系簡(jiǎn)便、快捷地反映細(xì)胞密度和生物質(zhì)變化。如果使用其它測(cè)定波長(zhǎng)，就必須先建立干重-OD值和細(xì)胞密度-OD值的回歸方程(非直線(xiàn)方程)。需要指出，對(duì)于非直線(xiàn)回歸方程，當(dāng)藻液經(jīng)過(guò)稀釋后，必須先根據(jù)稀釋后測(cè)得的OD值計(jì)算稀釋藻液的細(xì)胞密度或干重，然后乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算原藻液的細(xì)胞密度或干重，而不能根據(jù)稀釋后藻液的OD值和稀釋倍數(shù)計(jì)算原藻液的OD值，然后再利用回歸方程計(jì)算原藻液的細(xì)胞密度或干重。

分批培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞經(jīng)歷了旺盛增殖期和衰老期，細(xì)胞形態(tài)、大小處于不斷變化中。無(wú)論哪種測(cè)定波長(zhǎng)，4種微藻DW/OD的比值均隨著培養(yǎng)時(shí)間不斷變化(表2)。藻液OD值與細(xì)胞密度、生物質(zhì)干重之間不存在有規(guī)律的數(shù)量關(guān)系，不能用回歸方程描述。所以，在分批培養(yǎng)模式下，測(cè)定藻液OD值反映細(xì)胞密度和生物質(zhì)的方法不適用，只有直接測(cè)定的細(xì)胞密度和生物質(zhì)才是準(zhǔn)確的。用OD值繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，在穩(wěn)定期以前，可以反映細(xì)胞密度或生物質(zhì)變化的趨勢(shì)，進(jìn)入穩(wěn)定期后，生長(zhǎng)曲線(xiàn)不能反映細(xì)胞密度或生物質(zhì)的變化。劉學(xué)銘等研究了分批異養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中小球藻光密度與干重的關(guān)系，結(jié)果表明DW/OD的比值先升后降，變化范圍0.53—0.28[19]。可見(jiàn)，測(cè)定藻液OD值反映細(xì)胞密度和生物質(zhì)的方法不僅不適用于光合自養(yǎng)分批培養(yǎng)，也不適用于異養(yǎng)分批培養(yǎng)。

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The relationships between optical density, cell number, and biomass of four microalgae

LIANG Fang1,2, YA Qiao3, DU Weichun3, WEN Xiaobin1,2, GENG Yahong1, LI Yeguang1,*

1KeyLaboratoryofPlantGermplasmEnhancementandSpecialityAgriculture,WuhanBotanicalGarden,ChineseAcademyofSciences,Wuhan430074,China2UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China3YunnanSpirinBiotechnologyCO.Ltd,Kunming650106,China

To establish spectrophotometry as a method for estimating cell number and biomass of microalgal cultures, the relationships between optical density (OD), cell number, and dry weight (DW) were investigated for four familiar algae,Chlorellasp. XQ- 20044,Scenedesmussp. SS- 200716,Chlorococcumsp. andSpirulinasp. CH- 164. Algal suspensions with different cell concentrations were obtained by serial dilution of cultures in exponential growth, and their ODs determined by scanning at wavelengths from 350 nm to 800 nm. The cell numbers were determined by cell counting, and biomass (as DW) was determined by weighing. Further, the ODs of the autotrophic batch cultures were scanned during the growth process, and correlated with cell numbers and DWs of the same samples. The results were as follows: for the four microalgae, cell numbers and biomass-dry weight did not change linearly with the changes in OD at all the wavelengths examined. However, the relationships could be approximately described by a linear regression equation (R2> 0.98) at 435 nm, and were well described by binomial regression equations (R2> 0.99) at other wavelengths. In continuous and semi-continuous cultures, the OD at 435 nm was suitable for estimating cell number and biomass; however, in autotrophic batch cultures an increase of the DW to OD ratio was observed during culture growth for all four algae. The ratio (DW/OD) was 0.19 to 0.44 g/L forChlorella, 0.36 to 0.53 g/L forScenedesmus, 0.48 to 0.75 g/L forChlorococcumand 0.46 to 0.74 g/L forSpirulina. Thus, spectrophotometry was not suitable for estimating biomass-DW in batch culture. This study should help guide the proper application of spectrophotometry in microalgae culture.

microalgae; optical density; cell number; biomass dry weight

國(guó)家“863”項(xiàng)目(2013AA065805); 國(guó)家自然科學(xué)基金(31272680); 國(guó)家科技部科技基礎(chǔ)性工作專(zhuān)項(xiàng)(2012FY112900)

2013- 01- 31; 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2014- 03- 13

10.5846/stxb201301310207

*通訊作者Corresponding author.E-mail: yeguang@wbgcas.cn

梁芳，鴨喬，杜偉春，溫曉斌，耿亞洪，李夜光.微藻光密度與細(xì)胞密度及生物質(zhì)的關(guān)系.生態(tài)學(xué)報(bào),2014,34(21):6156- 6163.

Liang F, Ya Q, Du W C, Wen X B, Geng Y H, Li Y G.The relationships between optical density, cell number, and biomass of four microalgae.Acta Ecologica Sinica,2014,34(21):6156- 6163.