三氧化二砷對HBx-Hep G2細胞侵襲轉移能力的影響

彭土生，楊啟君，余桂芳

三氧化二砷對HBx-Hep G2細胞侵襲轉移能力的影響

彭土生，楊啟君，余桂芳

目的探討三氧化二砷(As2O3)對HBx-Hep G2細胞體外黏附、侵襲、遷移能力的影響及其機制。方法慢病毒介導構建HBx-Hep G2細胞模型，免疫細胞化學法檢測HBx蛋白表達，分別采用MTT法、Transwell小室檢測As2O3對HBx-Hep G2細胞黏附、遷移、侵襲能力的影響，免疫組化方法檢測As2O3作用前后HBx-Hep G2細胞CD44V6表達的改變。結果構建后的HBx-Hep G2細胞呈現HBx陽性信號，主要分布于胞漿，無局部高濃度聚集。隨著As2O3作用時間的延長及濃度增加，HBx-Hep G2細胞對Matrigel的黏附能力也隨之增加；與作用前相比，As2O3作用后HBx-Hep G2細胞游走與穿透基底膜的能力明顯受抑制[(128±8)vs.(102±7)、(96±5)vs.(85±6)]個/HP(P<0.05)；與As2O3作用前比較，H-SCOKE及陰性表達率均下降[(3.75±0.55) vs.(2.54±0.68)、(92.65±4.86)% vs.(63.27±5.98)%]能抑制HBx-Hep G2細胞CD44v6的表達(P<0.05)。結論As2O3能抑制HBx-Hep G2細胞與細胞的黏附、遷移和侵襲能力，其抑制作用可能與CD44v6的表達下調有關。

肝癌；HBx-Hep G2細胞；三氧化二砷；黏附；侵襲；CD44拼接異構體6

原發性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，大部分肝癌患者就診時已失去手術機會,且大部分肝癌患者有乙型肝炎病毒感染基礎，肝功能儲備能力差，影響化療藥物的應用。研究證實，乙肝病毒X基因(hepatis B virus X gene,HBx)可參與肝細胞轉化、細胞凋亡調控、DNA修復等[1，2]；并可促進腫瘤血管增生，增加肝癌惡性程度，加速腫瘤的侵襲與轉移[3～5]。探討低毒有效化療藥物，抑制肝癌復發轉移可延長肝癌患者的生存期，改善其生活質量。三氧化二砷(As2O3)應用于白血病治療已有多年的歷史，研究證實其具有細胞毒作用以及促進腫瘤細胞凋亡、抑制細胞轉移等作用。余桂芳等[6]通過體外實驗證實As2O3可抑制人肝癌細胞的侵襲轉移能力，但尚未對HBx相關人肝癌細胞(HBx-Hep G2)侵襲轉移能力影響進行研究。因此，探討其對HBx-Hep G2細胞侵襲轉移能力的影響，對完善As2O3抗肝癌侵襲轉移治療可提供全面的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌Hep G2細胞株由廣州醫科大學微生物免疫教研室提供；24孔Transwell小室(孔徑8 μm)購自Costar公司；Matrigel及層黏連蛋白購自美國BD公司；反轉錄PCR試劑盒，大腸桿菌DH5α， HEK293細胞、Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性內切酶HindIII、EcoRI，T4 DNA連接酶，DNA marker均購自TaKaRa公司；慢病毒表達系統由東莞博捷生物科技公司提供；DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司；嘌呤霉素購自Sigma公司；TRIzol，Alex568標記的山羊抗人IgG均購自Invitrogen公司；兔源抗HBx抗體以及變異型白細胞分化抗原(CD44v6抗體)購自武漢博士德生物科技公司，二抗檢測試劑盒購自上海基因公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養： 人肝癌Hep G2細胞培養于RPMI-1640培養液中(含10%小牛血清，青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml)，在含5%CO2的37℃孵箱中培養。細胞呈貼壁狀態，每2～3天傳一代，全部實驗均用指數生長期細胞。

1.2.2 HBx-Hep G2細胞模型的建立： 應用PCR從質粒pIERES2-EGFP-HBV中擴增X基因片段，克隆至慢病毒載體pZac2.1，應用PCR、酶切和測序鑒定正確后，經病毒包裝，感染Hep G2細胞，經嘌呤霉素篩選穩定表達細胞株，免疫組化鑒定HBx的表達，以證實HBx-Hep G2細胞HBx穩定表達后將細胞分為2組，實驗組為As2O3組(0.25 μg/ml、0.5 pg/ml、1 μg/ml)，對照組為未用藥組，分別于30、60、90、120 min進行觀察。

1.2.3 HBx-Hep G2細胞對基底膜的黏附能力： 篩選出穩定表達HBx蛋白的HBx-Hep G2細胞，給予不同濃度As2O3培養24 h后，用胰酶消化為單細胞懸液，臺盼藍染色后計數。Matrigel包被96孔板，2%BSA封閉。細胞懸液加入包被好的96孔板中，分別作用30、60、90、120 min后吸出培養液及未黏附的細胞，每孔加入5 mg/L的MTT 20 μl，用酶標儀于波長570 nm處測定各孔吸光度值(OD值)，以OD值代表黏附細胞數，按下列公式計算細胞黏附率：黏附率=(黏附前細胞的吸收值-黏附后細胞的吸收值)/ 黏附前細胞吸收值×100%。

1.2.4 HBx-Hep G2細胞侵襲及游走能力： 將Matrigel按上法稀釋后，每室100 μl均勻鋪于小室腔膜上，成膠后于小室濾膜下面均勻涂上5 μg層黏連蛋白，放進24孔板中，紫外線照射2 h。實驗前以預熱的無血清培養基37℃水化，90 mim后去除培養基，將經0.5 μg/ml的As2O3作用24 h前后的單細胞懸液加入其中。孵育箱培養24 h；取出各組Transwell小室，酒精固定，HE染色，中性樹膠封片后光鏡下觀察5個視野穿膜細胞數，計算平均每個視野細胞。游走實驗與侵襲實驗相似，僅在Transwell小室腔上不鋪Matrigel。

1.2.5 HBx-HepG細胞CD44v6的表達： 細胞經0.5 μg/ml的As2O3作用前及作用24 h后，按常規方法免疫細胞化學染色。CD44v6主要表達于細胞膜與細胞漿中，其陽性表達以細胞質及質膜出現明顯的黃棕色顆粒狀沉積為準。排除爬片邊沿細胞。10×10低倍鏡下隨機選取10個細胞分布均勻的視野，每視野10×20倍鏡下隨機計數50個細胞。按細胞著色強弱分為4個等級：無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。按公式H-SCORE=∑Pi(i+1)(i=0，1，2，3；Pi表示評分為i的比例)計算爬片H-SCORE得分。該評分方法較具體、真實地從總體水平反映細胞內蛋白表達的情況。陽性率=(淡黃色+棕黃色+棕褐色)細胞數/總細胞數×100%。

2 結 果

2.1 HBx蛋白表達 構建后的HBx-Hep G2細胞，免疫組化染色后,幾乎所有細胞呈現HBx陽性信號, 主要分布于胞漿, 無局部高濃度聚集。圖1見封3。

2.2 HBx-Hep G2細胞黏附 隨著As2O3作用時間的延長，HBx-Hep G2細胞對Matrigel的黏附能力隨之增強；隨著As2O3作用濃度的增加，其抑制Matrigel黏附的能力也隨之加強，不同時間點之間及不同作用濃度之間兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。 見表1。

表1 不同時間、不同濃度As2O3作用后HBx-Hep G2細胞對Martrigel黏附率的影響

2.3 穿透基底膜與遷移能力 與As2O3作用前比，As2O3作用后HBx-Hep G2細胞的侵襲與遷移能力(128±8)個/HP vs.(102±7)個/HP，(96±5)個/HP vs.(85±6)個/HP均下降(P<0.05)。

2.4 CD44v6在細胞的表達 As2O3作用前，按常規方法免疫細胞化學染色， CD44v6蛋白主要在胞膜與胞漿內黃棕色顆粒沉積，H-SCORE為(3.75±0.55)，CD44v6在細胞的表達陽性率為(92.65±4.86)%，均高于As2O3作用后，H-SCORE為(2.54±0.68)，CD44v6在細胞的表達陽性率為(63.27±5.98)%(P<0.05)。圖2見封3。

3 討 論

原發性肝癌以其高度惡性、生長迅速、易于轉移復發為特征。復發轉移嚴重影響了肝癌患者的預后。肝癌的高度惡性、復發轉移特性與其特殊的發病機制有很大關系，多項研究表明乙型肝炎病毒的慢性感染與肝細胞癌的發生、發展具有十分密切的關系，90%的肝癌與乙型肝炎有關[7，8]。在乙型肝炎病毒中X基因與肝癌的發生發展更為密切。最近幾年國內外均有研究發現，HBx基因的一個新功能——促進肝癌細胞的侵襲轉移，其具體作用可能通過其表達的HBx蛋白誘導肝癌細胞向運動表型轉化，包括細胞骨架重排，偽足形成，CD44表達上調或通過整合素β1提高肝癌細胞在基質中的黏附和運動、通過轉錄因子NF-AT上調環氧合酶-2和膜型基質金屬蛋白酶的表達以促進肝癌細胞對基質的降解等作用，從而促進了肝癌細胞的侵襲與遷移[9～12]。

雖然局部治療對肝癌患者發揮了主要作用，其中經肝動脈化療栓塞(TACE)成為中晚期肝癌治療的主要手段，然而多中心臨床隨機對照分析提示，術前TACE不能延長可切除肝癌患者的生存期，僅能延緩而不是阻斷肝癌發展，患者中位生存期最多延長至16個月,少數臨床觀察也發現經肝動脈化療栓塞本身促進殘癌細胞的侵襲、轉移；研究發現適度缺氧促進了肝癌細胞的侵襲轉移能力，一定程度的栓塞可能加重了肝癌的復發轉移[13，14]。提示肝癌化療栓塞治療后輔以抗腫瘤侵襲轉移有著重要的臨床意義。

肝癌由于特殊的發病基礎以及化療藥本身對肝臟的損傷作用，限制了常規化療藥物在肝癌治療上的運用，探討低毒的抗侵襲轉移藥，以便更好的較長時間治療顯得更有必要。As2O3作為一種抗腫瘤藥物運用于臨床有悠久的歷史，其具有促進腫瘤細胞凋亡與誘導細胞分化、抑制端粒酶作用，不少研究也證實As2O3具有抗腫瘤侵襲轉移作用[15～18]，同時As2O3與常規順鉑等化療藥相比其毒副作用明顯減輕，因此有望作為一種抗肝腫瘤轉移藥物運用于臨床。

本文通過慢病毒介導構建了能穩定表達HBx蛋白的人肝癌細胞模型，并通過免疫組化法證實了HBx蛋白的穩定表達。以穩定表達HBx蛋白的HBx-Hep G2細胞為實驗對象，在既往As2O3抗肝癌侵襲轉移的研究基礎上，針對臨床肝癌大部分與乙型肝炎病毒感染相關，構建了HBx相關肝癌細胞模型，使實驗對象更接近臨床實際，進一步完善了As2O3的抗肝癌侵襲轉移作用研究。結果顯示，不同濃度的As2O3抑制了HBx相關人肝癌細胞對Matrigel的黏附，并隨著濃度的增加其抑制率越高。

更進一步的體外侵襲轉移實驗探討了As2O3對HBx相關人肝癌細胞穿透基底膜及遷移運動的影響。本實驗運用Transwell小室細胞培養模型，是綜合判斷腫瘤侵襲轉移能力，分析腫瘤細胞黏附、降解和穿透移行能力及相互間聯系的最有效且較經典的實驗方法，已廣泛應用于腫瘤體外侵襲轉移能力的檢測。小室內不鋪Matrigel基膜，可檢測腫瘤體外移行能力。實驗結果顯示As2O3作用后的HBx相關人肝癌細胞其穿透基底膜及遷移運動能力均受到抑制，證實了As2O3對HBx同樣具有抑制穿透基底膜及運動能力，為其臨床運用提供更強的實驗基礎。

對基底膜的黏附是腫瘤細胞實現侵襲轉移的第一步，黏附過程借助多種細胞因子參加，CD44是目前研究較多的一種細胞黏附分子。分化抗原CD44是存在于各種細胞表面的跨膜糖蛋白分子，根據外顯子的表達情況CD44分為標準型、上皮型、變異型3種，CD44v6是CD44眾多的亞型之一，大量的證據表明多種惡性腫瘤組織如肝癌、胃癌、結腸癌、肺癌等普通存在CD44v6表達失控，其高表達與多種惡性腫瘤的發展、侵襲、轉移密切相關[19～21]。本實驗通過免疫細胞化學技術檢測了HBx-Hep G2細胞CD44v6的表達，提示CD44v6在HBx-Hep G2細胞中同樣呈強陽性表達。經As2O3作用72 h后，CD44v6蛋白的表達明顯下降。已有體外實驗顯示CD44v6參與了癌細胞與基底膜主要成分Laminin和IV型膠原的黏附，其促進腫瘤侵襲轉移可能與其促進腫瘤細胞與血管內皮細胞、基底膜的黏附作用，同時提高了腫瘤細胞的遷移運動能力有關。本實驗也顯示經As2O3作用后，HBx-Hep G2細胞中CD44v6表達下降，提示HBx-Hep G2細胞對基底膜的黏附抑制作用減弱、遷移運動能力下降可能與CD44v6的表達水平下降有關。本實驗結果提示As2O3對乙型肝炎病毒感染相關的肝癌患者可能同樣具有抗腫瘤侵襲轉移作用，值得臨床進一步研究證實。

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EffectofarsenictrioxideoninvasionandmetastasisofHBx-HepG2cell

PENGTusheng,YANGQijun,YUGuifang.

DepartmentofHepatology,theFifthAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510700,China

ObjectiveTo evaluate the effect of arsenic trioxide (As2O3) on HBx-Hep G2cells in vitro adhesion, invasion and migration of its mechanism.MethodsHBx-Hep G2cell model were built by lentivirus-mediated, immunocytochemistry assay protein HBx, respectively, using the MTT assay , Transwell chamber detection As2O3's effect on HBx-Hep G2cell adhesion, migration, invasion ability was detected. The role of As2O3on HBx-Hep G2cells CD44V6 expression changes were detected by immunohistochemistry.ResultsAfter built, HBx-Hep G2cells showed positive HBx signals, mainly distributed in the cytoplasm, no local high concentration of aggregation. With the increase of As2O3to extend the role of time and concentration, HBx-Hep G2cells on matrigel adhesion capacity also increased; compared with the previous, after using of As2O3, HBx-Hep G2and penetrate the basement membrane of the cell migration was markedly inhibited [(128±8)vs.(102±7),(96±5)vs.(85±6)] /HP (P<0.05); compared with before As2O3effects, H-SCOKE rate and negative expression were decreased [(3.75±0.55)vs.(2.54±0.68),(92.65±4.86)%vs.(63.27±5.98)%].It can inhibit the expression of CD44v6 HBx-Hep G2(P<0.05).ConclusionAs2O3can inhibit HBx-Hep G2cell-cell adhesion, migration and invasion, and its inhibition may be associated with down-regulation of the expression of CD44v6.

Liver cancer;HBx-Hep G2;Arsenic trioxide;Adhesion;Invasion;CD44 splice isoforms 6

廣東省中醫藥強省科研項目(No.20132202)

510700 廣州醫科大學附屬第五醫院肝病區

余桂芳，E-mail:yuguifang2004@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.05.021

2014-01-14)