荔枝核總黃酮改善膽總管結(jié)扎大鼠膽汁淤積癥狀的研究*

成秋宸 趙永忠△ 肖緒華 劉瑞彪 黃大健 李勝聯(lián) 徐 慶

荔枝核總黃酮改善膽總管結(jié)扎大鼠膽汁淤積癥狀的研究*

成秋宸1趙永忠1△肖緒華1劉瑞彪2黃大健1李勝聯(lián)3徐 慶4

目的觀察荔枝核總黃酮（TFL）對膽汁淤積性肝纖維化大鼠肝功能p16蛋白、3型膠原（PC3）和Ⅰ型膠原（PCⅠ）的影響。方法40只大鼠隨機分為假手術(shù)（SO）組、膽總管結(jié)扎（BDL）組、TFL組和水飛薊賓膠囊（SIL）組。SO組、BDL組生理鹽水灌胃5 mL/(kg·d)，TFL組TFL灌胃200 mg/(kg·d)，SIL組SIL灌胃5 mL/(kg·d)，均持續(xù)4周。取血清檢測血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、直接膽紅素（BILD）、總膽紅素（BILT）。取肝組織行HE、Masson染色；Western blot檢測p16、PC3、PCⅠ的表達。結(jié)果SO組ALT（IU/L：44.6±8.0）、AST（IU/L：103.8±18.1）、BILD（μmol/L：0.76±0.28）、BILT（μmol/L：1.48±0.35）值最低；BDL組ALT（147.4±86.3）高于TFL組（92.9±47.3），AST（362.7±106.6）高于TFL組（290.1±171.7）和SIL組（250.2±54.9），BILD（99.71±40.87）低于SIL組（137.01±38.86）；TFL組BILD（81.48±47.50）、BILT（106.64±61.04）均低于SIL組（均P＜0.05）。TFL組存在少量新生膽管，細胞水腫變性不明顯，少量炎細胞浸潤及膠原沉積，較BDL組肝纖維化程度明顯改善。SIL組肝匯管區(qū)新生膽管較TFL組明顯，有細胞變性水腫，炎細胞浸潤，匯管區(qū)有纖維間隔，程度較BDL組輕，匯管區(qū)有膠原沉積。BDL組p16、PC3、PCⅠ蛋白表達高于TFL組，PC3蛋白低于SIL組，PCⅠ蛋白高于SIL組（均P＜0.05），p16蛋白與SIL組差異無統(tǒng)計學意義；TFL組PC16、PC3蛋白表達低于SIL組（P＜0.05），PCⅠ蛋白與SIL組差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論TFL可改善膽汁淤積性肝纖維化大鼠肝功能，減輕肝組織纖維化；其機制可能與抑制肝組織p16、PC3、PCⅠ蛋白表達有關(guān)。

荔枝核總黃酮；膽汁淤積性肝纖維化;Ⅰ型膠原蛋白;3型膠原蛋白;p16

膽汁淤積性肝病是一組以膽汁淤積為主要原因，以肝臟纖維化為主要表現(xiàn)的疾病，黃疸是其最明顯的臨床表現(xiàn)。去除病因是其根本的治療措施，同時應(yīng)考慮對肝細胞的保護，改善膽汁淤積，減輕和消除黃疸[1]。研究發(fā)現(xiàn)荔枝核作為傳統(tǒng)中藥，在保肝、抗氧化等方面具有較好的療效[2]。本課題組前期研究顯示荔枝核總黃酮（total flavone from litchi chinensis sonn，TFL）對膽汁淤積性肝纖維化大鼠有較好的抗纖維化療效[3-4]。本研究采用膽總管結(jié)扎（bild duct ligation，BDL）制備繼發(fā)性膽汁淤積性肝纖維化大鼠模型，觀察TFL對大鼠肝功能、p16蛋白、3型膠原（PC3）和Ⅰ型膠原（PCⅠ）的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 雄性SD大鼠40只，SPF級，體質(zhì)量150～170 g，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心（許可證號：SCXK桂2009-0002），由桂林醫(yī)學院實驗動物中心飼養(yǎng)、造模，溫度15～20℃，濕度60%～70%，光照隨晝夜變化，自由飲食水。采用完全隨機法將大鼠分為假手術(shù)（sham operation，SO）組、BDL組、TFL組和水飛薊賓膠囊（silybinin，SIL）組，每組10只。

1.2 藥物 原料荔枝核購自桂林市七星公園藥材市場，經(jīng)鑒定為無患子科植物荔枝的成熟種子，由桂林工學院有機化學教研室經(jīng)漂洗干燥粉碎，乙醇回流提取TFL，經(jīng)高效液相色譜分析其TFL成分為853 g/kg，用蒸餾水溶解為40 g/L溶液。SIL購自天津天士力集團，每顆膠囊含SIL35 mg。

1.3 主要試劑 超氧化物歧化酶（SOD）測試盒購于南京建成生物工程研究所。肝功能試劑盒，包括血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、直接膽紅素（BILD）、總膽紅素（BILT），BCA蛋白定量試劑盒均購自北京碧云天生物公司，抗p16單克隆抗體購自BD公司，抗β-actin單克隆抗體購自CST公司，抗PC3多克隆抗體購自Abcam公司，抗PCⅠ（Pro COL1A2）多克隆抗體購自santa cruz公司。辣根過氧化物酶（HRP）標記兔抗山羊、山羊抗小鼠抗體均購自北京中杉金橋生物公司，Western blot蛋白預(yù)染marker購自美國NEB公司，化學發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司。

1.4 模型制備與給藥 按照文獻[5]的方法制備BDL大鼠模型。入實驗室適應(yīng)1周后，BDL、TFL和SIL組大鼠行腹腔注射水合氯醛麻醉，腹部皮膚常規(guī)消毒，沿腹正中線切開，游離膽總管并雙重結(jié)扎后于節(jié)間切斷，SO組僅分離膽總管后關(guān)腹，不結(jié)扎不切斷膽總管。術(shù)后第2天，SO組和BDL組用生理鹽水灌胃5 mL/(kg·d)，TFL組用40 g/L的TFL灌胃200 mg/(kg·d)，SIL組用10 g/L的SIL灌胃5 mL/(kg·d)[6]，均持續(xù)4周。BDL組大鼠死亡2只，SIL組死亡1只，死亡原因為急性肝衰竭，SO組和TFL組大鼠均無死亡。

1.5 樣品采集與處理 術(shù)后4周，采用放血法處死大鼠，摘取肝臟測量并稱其質(zhì)量，留取大鼠肝右葉組織，冰生理鹽水清洗后，10%中性福爾馬林固定72 h后制備石蠟標本，放置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 觀察項目與方法 （1）一般情況：大鼠耳部、爪部皮膚黏膜顏色，尾部淤斑，舌色，肝臟形態(tài)、質(zhì)地等。（2）肝指數(shù)（肝臟濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）和SOD含量。（3）肝功能：電化學發(fā)光法檢測ALT、AST、BILD和BILT。（4）肝組織病理學觀察：HE、Masson染色，光鏡下觀察肝組織的病理變化，根據(jù)肝纖維結(jié)締組織增生程度將肝纖維化分為0～4期[7]。（5）Western blot檢測：每個標本經(jīng)液氮研磨提取總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，BSA封閉，用一抗（p16、PC3和PCⅠ，均為1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜，TBST洗滌后加相應(yīng)HRP二抗室溫孵育1 h，洗滌，ECL顯影，Kodak Image Station 4000R化學發(fā)光成像系統(tǒng)曝光，同一張膜用一抗二抗去除液洗脫后，封閉，加入β-actin抗體稀釋液（1∶1 000稀釋）孵育，作為內(nèi)參照。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用PEMS 3.1軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，行方差齊性檢驗，方差齊者多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗；方差不齊者采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，組間多重比較采用t檢驗。等級計數(shù)資料多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，組間多重比較采用Nemenyi法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 SO組大鼠毛發(fā)光滑，耳廓色粉，爪色淡粉，舌色粉，尾巴無淤斑，肝臟柔軟。BDL組大鼠毛發(fā)干枯，耳廓色黃，爪色黃，舌色黯紅，尾巴大量淤斑，肝臟體積大，質(zhì)硬，色黃，邊緣鈍。TFL組大鼠毛發(fā)稍干枯，耳廓色淺黃，爪色淡黃，舌色淡紅，尾巴稍有淤斑，肝臟體積稍大，質(zhì)稍硬，色淡黃，邊緣稍鈍。SIL組大鼠毛發(fā)干枯，耳廓色黃，爪色淡黃，舌色紅，尾巴有淤斑，肝臟體積增大，質(zhì)稍硬，色黃，邊緣鈍。

2.2 各組大鼠血清學指標比較

2.2.1 各組大鼠肝指數(shù)和SOD值比較 BDL、TFL和SIL組肝指數(shù)均高于SO組（均P＜0.05），但BDL、TFL和SIL這3組間差異無統(tǒng)計學意義。除BDL組SOD值顯著低于SO組（P＜0.05）外，其他各組SOD值差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

Table 1 Comparison of liver index and SOD value between four groups表1 各組大鼠4周肝指數(shù)及SOD值的比較

2.2.2 各組大鼠肝功能的比較 BDL、TFL和SIL組ALT、AST、BILD、BILT水平均高于 SO組（均P＜0.05）；TFL組ALT、AST均低于BDL組（均P＜0.05）；SIL組AST低于BDL組，BILD高于BDL組和TFL組，BILT高于TFL組（均P＜0.05），見表2。

Table 2 Comparison of liver function between four groups表2 各組大鼠血清肝功能水平的比較

2.3 各組大鼠肝組織病理學改變

2.3.1 各組大鼠肝組織HE及Masson染色 SO組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，由肝匯管區(qū)呈條索狀放射狀排列，見圖1A，無膠原沉積，見圖2A。BDL組多數(shù)肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，有大量肝細胞變性和嗜酸性粒細胞變性，炎細胞浸潤，部分存在脂肪變性，匯管區(qū)有大量新生膽管，見圖1B，纖維間隔擴大，膠原增多，見圖2B。TFL組肝匯管區(qū)結(jié)構(gòu)存在，少量新生膽管，細胞水腫變性不明顯，少量炎細胞浸潤，見圖1C，少量膠原沉積，見圖2C。SIL組肝匯管區(qū)新生膽管較TFL組明顯，有細胞變性水腫，炎細胞浸潤，匯管區(qū)有纖維間隔，程度較BDL組輕，見圖1D，匯管區(qū)有膠原沉積，見圖2D。

2.3.2 各組纖維化程度分期比較 SO組以0期為主，BDL組以3、4期為主，TFL組以1、2、3期為主，SIL組以2、3期為主，其中BDL組、SIL組與SO組比較差異有統(tǒng)計學意義，見表3。

Table 3 Comparison of stagings of liver fibrosis between four groups表3 各組肝纖維化程度分期比較

Figure 4 Comparison of expressions of p16，PC3 and PCⅠproteins in rat liver tissues between four groups圖4 各組肝組織p16、PC3、PCⅠ蛋白表達水平比較

2.4 各組肝組織p16、PC3、PCⅠ蛋白表達的比較 見圖3、4。BDL、TFL和SIL組p16、PC3、PCⅠ蛋白的表達均高于SO組（均P＜0.05）。TFL組p16、PC3、PCⅠ蛋白的表達均低于BDL組（均P＜0.05）。SIL組p16蛋白的表達與BDL組差異無統(tǒng)計學意義，而高于TFL組（P＜0.05）；SIL組PC3蛋白的表達高于BDL組和TFL組（P＜0.05）；SIL組PCⅠ蛋白的表達低于BDL組（P＜0.05），與TFL組比較差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

膽汁淤積是膽汁淤積性肝病的主要表現(xiàn)，是發(fā)展為肝硬化及進一步發(fā)展為肝癌的前奏[2]。羅偉生等[4]研究發(fā)現(xiàn)，TFL可使二甲基亞硝胺所致的肝纖維化大鼠血清SOD含量明顯升高，進而通過降低機體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)來減輕肝損傷及肝纖維化程度。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后4周，BDL組大鼠毛發(fā)干枯，耳廓、爪色黃，舌色黯紅，尾部出現(xiàn)淤血斑；TFL組與SIL組大鼠耳廓顏色、舌色、爪色、毛發(fā)的光澤度，以及尾巴淤血癥狀較BDL組有明顯改善。TFL組ALT、AST均低于BDL組，BILD、BILT均低于SIL組，且病理結(jié)果顯示TFL組肝纖維化程度明顯改善，提示TFL有較好的保護肝細胞、改善肝功能、降低膽紅素和抗肝纖維化的作用。TFL的退黃機制可能是通過轉(zhuǎn)甲基作用，恢復(fù)和提高肝細胞膜流動性以及增加Na+/K+-ATP酶泵的活性，從而激活膽汁輸送機制，改善肝內(nèi)膽汁淤積[8]；另外，還可通過轉(zhuǎn)硫基作用，增加谷胱甘肽的合成，進而提高抗氧化和抗自由基能力，從而提供肝細胞的保護作用[9]。但具體機制尚需進一步的實驗驗證。

凋亡因子和衰老理論是近幾年開發(fā)中成藥治療肝纖維化的新思路[10]。p16-pRb和p53-p21-pRb是與細胞衰老相關(guān)調(diào)控的主要途徑[11]。Hirsova等[12]報道在肝纖維化硬化過程中腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）的作用是誘導(dǎo)肝實質(zhì)細胞凋亡，促進肝纖維化向肝硬化的發(fā)展。孫旭銳等[13]研究表明TFL在體外通過誘導(dǎo)凋亡來抑制大鼠肝星狀細胞增殖。本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)TFL能抑制膽汁淤積性肝纖維化大鼠TRAIL的表達[5]。PCⅠ是肝纖維化、肝硬化時肝細胞外基質(zhì)的主要成分，可作為反映膠原代謝的重要參數(shù)，是判斷肝纖維化的嚴重程度和抗纖維化治療的療效指標之一[14]。本研究結(jié)果顯示TFL可明顯抑制膽汁淤積性肝纖維化大鼠肝臟p16、PC3、PCⅠ蛋白的表達，提示其可能與TFL通過誘導(dǎo)細胞凋亡來抑制肝纖維化有關(guān)。

SIL作為生物類黃酮，因具有抗氧自由基，抗脂質(zhì)過氧化[15]，保護肝細胞改善肝功能的作用，而被FDA批準作為抗肝纖維化用藥。本研究結(jié)果顯示TFL組p16、PC3蛋白的表達均低于SIL組，PCⅠ蛋白與SIL組無明顯差異,提示用TFL治療膽汁淤積性肝纖維化大鼠，在護肝、退黃、抗纖維化方面具有獨特優(yōu)勢，其可能是通過誘導(dǎo)肝細胞凋亡，促進肝細胞再生，降低匯管區(qū)膽管增生等機制來抑制肝纖維化的發(fā)展。但TFL是否可作為抗肝纖維化的新型中藥制劑應(yīng)用于臨床，尚需進一步深入研究。

Figure 1 HE staining of light microscopy images in four groups(×100)圖1 各組大鼠肝臟光鏡HE染色圖（×100）

Figure 2 Masson staining of light microscopy images in four groups(×100)圖2 各組大鼠肝臟光鏡Masson染色圖（×100）

Figure 3 Comparison of expressions of PC3，p16and PCⅠproteins in rat liver tissues between four groups圖3 各組大鼠肝組織PC3、p16、PCⅠ蛋白表達電泳結(jié)果

[1] 陸倫根,胡俊杰.肝纖維化研究進展[J].肝臟,2012,17(9):617-620.

[2]Friedman SL.Evolving challenges in hepatic fibrosis[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2010,7(8):425-436.

[3]趙永忠,肖緒華,漆志平,等.荔枝核總黃酮對大鼠肝纖維化TGF-β1及CTGF表達的影響[J].河北醫(yī)藥,2010,32(10):1194-1196.

[4] 羅偉生,歐士鈺,靳雅玲,等.荔枝核總黃酮抗肝纖維化作用的實驗研究[J].重慶醫(yī)學,2013,42(4):373-378.

[5] 趙永忠,漆志平,徐慶,等.荔枝核總黃酮抗膽管結(jié)扎大鼠肝纖維化的作用及機制[J].世界華人消化雜志,2010,18（20）:2084-2089.

[6]Jia JD,Bauer M,Cho JJ,et al.Antifibrotic effect of silymarin in rat secondary biliary fibrosis is mediated by downregulation of procollagen alpha1(I)and TIMP-1[J].J Hepatol,2001,35（3）:392-398.

[7]中華肝臟病學會肝纖維化學組.肝纖維化診斷及療效評估共識[J].藥品評價,2007,4(4):265-266.

[8]Hegazy SK,El-Bedewy M,Yagi A.Antifibrotic effect of aloe vera in viral infection-induced hepatic periportal fibrosis[J].World J Gastroenterol,2012,18(17):2026-2034.

[9]Idrissi ME,Hervieu V,Merle P,et al.Cause-specific telomere factors deregulation in hepatocellular carcinoma[J].J Exp Clin Cancer Res,2013,32(1):64.

[10]Lavallard VJ,Bonnafous S,Patouraux S，et al.Serum markers of hepatocyte death and apoptosis are non invasive biomarkers of severe fibrosis in patients with alcoholic liver disease[J].PLoS One,2011,6(3):e17599.

[11]孔德松,魏東華,張峰，等.肝纖維化進程中細胞衰老的作用及相關(guān)機制的研究進展[J].中國藥理學與毒理學雜志,2012,26(5):688-691.

[12]Hirsova P,Ibrahim SH,Bronk SF,et al.Vismodegib suppresses trailmediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis[J].PLoS One,2013,8(7):e70599.

[13]孫旭銳,覃浩,羅偉生,等.荔枝核總黃酮對大鼠肝星狀細胞增殖的抑制作用[J].廣東醫(yī)學,2012,33(15):2215-2217.

[14]Hennenberg M,Trebicka J,Kohistani Z,et al.Hepatic and HSC-specific sorafenib effects in rats with established secondary biliary cirrhosis[J].Lab Invest,2011,91(2):241-251.

[15]盛云建,吳剛,陳炘，等.靈芪蠲肝液抗CCl4誘導(dǎo)的肝損傷機制研究[J].天津醫(yī)藥,2012,40(3):258-261.

（2013-08-20收稿 2013-10-20修回）

（本文編輯 陳麗潔）

An Experimental Study of Total Flavone from Litchi Chinensis Sonn Improving Symptoms of Cholestatasis in BDL Rats

CHENG Qiuchen1,ZHAO Yongzhong1,XIAO Xuhua1,LIU Ruibiao2,HUANG Dajian1,LI Shenglian3,XU Qing4
1 Department of Digestive Medicine,The Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin 541001,China，2 Department of Laboratory;3 School of Public Health，Guilin Medical University；4 College of Pharmacy，Guilin Medical University

ObjectiveTo observe the effects of total flavone from litchi chinensis sonn(TFL)on the liver function including p16 protein,pro collagen type 3(PC3)and pro collagen typeⅠ(PCⅠ)in model rats with liver fibrosis induced by bile duct ligation.MethodsForty rats were randomly divided into four groups:sham operation(SO)group,bile duct ligation(BDL)group,TFL group and silibinin(SIL)group.Rats were gavaged with saline(5 mL·kg-1·d-1)in SO and BDL group,rats were gavaged with TFL(200 mL·kg-1·d-1)in TFL group and rats were gavaged with SIL(5 mL·kg-1·d-1)in SIL group for four weeks.The serum levels of alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST),bilirubin direct(BILD)and bilirubin total(BILT)were detected in four groups.The liver tissues were stained by HE and Masson methods.The expression levels of p16,PC3 and PCⅠin liver tissues were determined by Western blot assay.ResultsThe serum levels of ALT(44.6 IU/L±8.0 IU/L),AST(103.8 IU/L±18.1 IU/L),BILD(0.76 μmol/L±0.28 μmol/L)and BILT(1.48 μmol/L±0.35 μmol/L)were lower in SO group.There was a higher level of ALT in BDL group(147.4 IU/L±86.3 IU/L)than that of TFL group(92.9 IU/L±47.3 IU/L).The serum level of ALT was higher in AST group(362.7 IU/L±106.6 IU/L)than that of TFL group(290.1 IU/L±171.7 IU/L)and SIL group(250.2 IU/L±54.9 IU/L).The serum level of BILD was lower in BDL group(99.71 μmol/L± 40.87 μmol/L)than that of SIL group(137.01 μmol/L ± 38.86 μmol/L).The serum levels of BILD and BILT were significantly lower in TFL group(81.48 μmol/L±47.50 μmol/L,106.64 μmol/L±61.04 μmol/L)than those of SIL group(P＜0.05).There were small amount of new bile duct and no obvious cells degeneration,small amount of infiltration of inflammatory cells and collagen deposition in TFL group.The liver fibrosis improved significantly in TFL group than that of BDL group.There were more new bile duct in hepatic portal area in SIL group than those of TFL group.The expression levelsof p16,PC3 and PCⅠwere significantly higher in BDL group than those of TFL group.The expression level of PC3 was significantly lower in BDL group than that of SIL group.The expression level of PCⅠwas significantly higher in BDL group than that of SIL group(P＜0.05).There was no significant difference in the expression level of p16 between BDL group and SIL group.The expression levels of PC16 and PC3 were significantly lower in TFL group than those of SIL group(P＜0.05).There was no significant difference in the expression level of PCⅠbetween TFL group and SIL group.ConclusionTFL can improve the liver function in model rats with cholestatic liver fibrosis and reduce liver fibrosis,which may be related with inhibitory effects on the expressions of p16,PC3 and PCⅠ.

total flavone from litchi chinensis sonn;cholestatic liver fibrosis;PCⅠ;PC3;p16

R575.5 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.010

*國家自然科學基金資助項目（項目編號：81360659）；廣西壯族自治區(qū)教育廳科研資助項目（項目編號：201012MS172）;廣西壯族自治區(qū)自然科學基金項目（項目編號：2012GXNSFAA053105）

1桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（郵編541001），2檢驗科；3桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院；4桂林醫(yī)學院藥學院

△通訊作者 E-mail：zyz-1968@163.com