反義miR-30d對乳腺癌細胞侵襲遷移能力的影響

陳 戈 駱 萍 龔 宇 周 瑤 趙瑞君 謝春偉

反義miR-30d對乳腺癌細胞侵襲遷移能力的影響

陳 戈 駱 萍 龔 宇 周 瑤 趙瑞君 謝春偉△

目的分析miR-30d在乳腺癌組織中的表達情況，體外研究反義miR-30d寡核苷酸（miR-30d ASO）對乳腺癌細胞侵襲和遷移的影響。方法運用熒光定量PCR檢測108例乳腺癌組織及對應正常癌旁組織中miR-30d的表達；通過miR-30d ASO降低乳腺癌細胞中miR-30d的表達，采用Transwell實驗和劃痕實驗觀察miR-30d ASO對乳腺癌細胞侵襲和遷移能力的影響，運用Western blot方法檢測侵襲相關蛋白基質金屬蛋白酶（MMP）-2和MMP-9蛋白的表達變化。結果乳腺癌組織中miR-30d基因表達水平明顯高于對應癌旁組織（P＜0.05）；與空白對照組和無義干擾組相比，miR-30d ASO可以顯著降低乳腺癌細胞miR-30d的表達（P＜0.05）；Transwell實驗和劃痕實驗結果顯示轉染miR-30d ASO后，乳腺癌細胞的侵襲及遷移能力明顯下降，同時MMP-2和MMP-9表達下降（P＜0.05）。結論miR-30d在乳腺癌組織中表達上調,降低miR-30d的表達可有效抑制乳腺癌細胞的侵襲和遷移。miR-30d有可能成為乳腺癌侵襲轉移調控的新靶點。

乳腺腫瘤；癌；腫瘤侵潤；細胞運動；miR-30d；反義寡核苷酸

MicroRNAs（miRNAs）是一種內源性的非編碼小分子RNA，其可以在轉錄后水平調節蛋白質的合成，廣泛分布于生物細胞體內。大量研究已經證實miRNAs在惡性腫瘤細胞的發生、發展中發揮重要作用，其中包括調控細胞的增殖、分化、凋亡、侵襲和轉移[1-2]。近年miR-30d在惡性腫瘤發生發展中的作用已受到廣泛關注。研究報道miR-30d在前列腺癌、成神經管細胞瘤以及肝癌等惡性腫瘤中表達上調[3-5]。過表達的miR-30d可以促進肝癌細胞的侵襲和轉移[5]。然而miR-30d在乳腺癌中的表達及其對乳腺癌細胞侵襲遷移能力的影響尚少見報道。本研究采用熒光定量PCR檢測miR-30d在乳腺癌組織中的表達；利用反義寡核酸技術（antisense oligonucleotide，ASO）抑制乳腺癌細胞中miR-30d的表達，分析miR-30d對乳腺癌細胞侵襲遷移能力的影響。同時檢查侵襲相關蛋白基質金屬蛋白酶（MMP）-2和MMP-9蛋白的表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 患者資料 收集2008年9月—2012年5月我院乳腺外科108例乳腺癌患者的乳腺癌組織及其正常癌旁組織手術標本，所有標本均經病理學檢查確診?；颊呔鶠榕裕挲g16～68歲，術前均未接受放化療。

1.1.2 主要試劑和儀器 乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞由本實驗室保存;DMEM高糖培養基（美國Gibco公司）、胎牛血清（美國Hyclone公司）、脂質體LipfectamineTM2000（美國Invitrogen公司）；反義miR-30d寡核苷酸（miR-30d ASO）購自大連寶生物公司；總蛋白提取試劑盒（北京普利萊）、兔抗人MMP-2和MMP-9單克隆抗體（美國santa cruz公司）、βactin二抗（北京中杉金橋公司）；Transwell Chamber（美國Chemicon公司），Matrigel（美國BD公司）；TaqMan miRNA分析試劑盒、熒光定量PCR分析儀7500（美國ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR檢測miR-30d的表達 采用RNA提取試劑盒提取癌組織及對應正常組織的總RNA，測定濃度后-80℃保存。運用miRNA分析試劑盒檢測miR-30d的表達。首先取2 μg總RNA為反應模板與3 μL逆轉錄酶混合，反應體系為20 μL，反應條件為：16 ℃ 30 min，45 ℃ 30 min，85℃5 min。反應結束后，收集cDNA。采用SYBR Green法定量檢測，將質粒稀釋品梯度稀釋為1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7和1×10-8，用于建立標準曲線。反應條件：95℃ 15 min；95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s，共45個循環；最后72℃延伸7 min。在每個循環的最后增加溶解曲線。閾值定義為基礎熒光信號的10個標準差，即時循環數為Ct，依據標準曲線計算目的基因的mRNA量。實驗重復3次。

1.2.2 miR-30d ASO序列設計 獲取人miR-30d的序列（http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam/mirna），設計其反義寡核苷酸序列，miR-30d:正義 5＇-AGUCACUAGUGGUUCCGUUUA-3＇，反義5＇-TAAACGGAACCACTAGTGACT-3＇，運用NCBI BLAST檢索程序以排除其他的同源序列。同時設計1條無義干擾陰性對照序列：正義5＇-UCUUCCGAACGUGUCACGUTT-3＇，反義:5＇-AAGUGACACGUUCGGAGAATT-3＇，送上海英駿生物技術公司合成。

1.2.3 細胞培養和反義寡核苷酸轉染 將MCF-7和MDAMB-231乳腺癌細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養基，37℃、5%CO2條件下培養。運用LipfectamineTM2000轉染試劑盒進行轉染，miR-30d ASO終濃度分別為：50、100、150、200和250 nmol/L。本實驗組篩選出最佳終干擾濃度為150 nmol/L。轉染后培養時間分別為24、48、72 h,初步篩出最佳作用時間為48 h。上述操作重復3次。

1.2.4 觀察miR-30d ASO對miR-30d表達的影響 轉染終濃度為150 nmol/L的miR-30d ASO 48 h后，提取總RNA，測定濃度，逆轉錄為cDNA（反應條件同1.2.1），測定cDNA濃度。運用microRNA檢測試劑盒檢測miR-30d的表達（具體條件同1.2.1）。上述操作重復3次。

1.2.5 Transwell侵襲實驗 實驗分為空白對照（MOCK）組、無義干擾（NC）組和干擾miR-30d（miR-30d ASO）組,下面的分組也是如此。Transwell小室的上下室之間以孔徑為8 μm的聚碳酸酯微膜孔分隔開，濾膜上層鋪蓋Matrigel。實驗開始前將Transwell小室復溫至37℃，在內室中加入300 μL的DMEM培養液，置于培養箱中孵育2 h，使Matrigel水化。用胰酶消化細胞成單細胞懸液，800 r/min離心5 min，收集細胞，用PBS洗滌細胞2次，最后用無血清的DMEM培養基重懸細胞，調整細胞數為1×106個/mL。吸出內室中培養液，吸取500 μL含10%血清的DMEM于外室中作為趨化因子，加300 μL細胞懸液于內室中，37℃、5%CO2培養箱中培養24 h。取出Transwell小室吸除培養基，利用棉簽擦凈Transwell小室濾膜上層的Matrigel及未穿過濾膜的細胞。將小室浸入細胞染色液中染色20 min，采用蒸餾水沖洗，風干。實驗中每組每次同時做3個重復小室，顯微鏡觀察計數，取平均值。

1.2.6 Transwell遷移實驗 具體過程與Transwell侵襲實驗基本一致，不同的是不需要鋪Matrigel。

1.2.7 劃痕實驗 采用Marker筆在6孔板背面均勻劃橫線，約0.5～1 cm寬，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線。在孔中加入約5×105個細胞，掌握為過夜細胞能鋪滿整孔。第2天用10 μL槍頭依橫線劃痕，注意槍頭垂直。PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入培養基。置于37℃、5%CO2培養箱培養。0 h、48 h取樣，用顯微鏡拍照測量各組劃痕愈合率情況。每個樣本至少重復3次。

1.2.8 Western blot檢測各組細胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達 運用總蛋白提取試劑盒提取MCF-7和MDA-MB-231細胞總蛋白，經10%SDS-PAGE電泳后轉膜，將膜放在含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中37℃封閉2 h，加一抗稀釋液1∶400稀釋兔抗人MMP-2和MMP-9單克隆抗體在4℃孵育過夜，1×TBST緩沖液3次（每次10 min），加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋），置于37℃孵育2 h，1×TBST緩沖液3次（每次10 min），運用ECL化學發光法檢測目的蛋白條帶。以β-actin作為內參。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，癌及癌旁組織比較采用配對樣本t檢驗，多組均數之間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌及癌旁組織miR-30d的表達情況 乳腺癌組織中miR-30d的表達明顯高于相應的正常癌旁組織（t=31.32，P ＜ 0.05），見圖1。

Figure 1 Comparison of the expression level of miR-30d between breast cancer and adjacent normal tissues圖1 乳腺癌及對應癌旁組織的miR-30d表達水平比較

2.2 抑制miR-30d對miR-30d表達的影響 MCF-7細胞中，miR-30d ASO組的miR-30d相對表達量較MOCK組和NC組明顯降低（F=391.66，P ＜0.05）；MDA-MB-231細胞實驗結果與MCF-7細胞結果一致（F=488.42，P ＜ 0.05），見圖2。

Figure 2 Comparison of the expression level of miR-30d between three groups(＊compared with the miR-30d ASO group,P ＜ 0.05)圖2 3組細胞中miR-30d的表達水平比較（＊與miR-30d ASO組比較，P ＜0.05）

2.3 Transwell侵襲實驗檢測抑制miR-30d的表達對乳腺癌細胞侵襲能力的影響 miR-30d ASO組的MCF-7細胞侵襲能力低于MOCK組及NC組（F=671.28，P＜0.05），而MOCK組與NC組之間無明顯差別（P ＞ 0.05），見圖3、4。MDA-MB-231細胞實驗結果與MCF-7細胞一致（F=741.18，P ＜ 0.05），見圖5、6。

Figure 3 Comparison of the invasion ability of MCF-7 cells between three groups(＊compared with the miR-30d ASO group,P ＜ 0.05)圖3 3組MCF-7細胞的侵襲能力比較（＊與miR-30d ASO組比較，P ＜0.05）

Figure 5 Comparison of the invasion ability of MDA-MB-231 cells between three groups(＊compared with the miR-30d ASO group,P＜0.05)圖5 3組MDA-MB-231細胞的侵襲能力比較（＊與miR-30d ASO組比較，P＜0.05）

2.4 Transwell遷移實驗檢測抑制miR-30d的表達對乳腺癌細胞遷移能力的影響 轉染miR-30d ASO組的MCF-7細胞遷移能力低于MOCK組及NC組（F=472.57，P ＜ 0.05），而MOCK組與NC組無明顯差別（P ＞ 0.05），見圖7、8。MDA-MB-231細胞實驗結果與MCF-7細胞一致（F=289.34，P ＜ 0.05），見圖9、10。

Figure 7 Comparison of the migration ability of MCF-7 cells between three groups(＊compared with the miR-30d ASO group,P ＜ 0.05)圖7 3組MCF-7細胞的遷移能力比較（＊與miR-30d ASO組比較，P＜0.05）

Figure 9 Comparison of the migration ability of MDA-MB-231 cells between three groups(＊compared with the miR-30d ASO group,P ＜ 0.05)圖9 3組MDA-MB-231細胞的遷移能力比較（＊與miR-30d ASO組比較，P＜0.05）

2.5 劃痕實驗檢測降低miR-30d基因表達對乳腺癌細胞遷移能力的影響 轉染48 h后，對于MCF-7細胞，miR-30d ASO組劃痕的愈合率明顯低于MOCK組和NC組（F=743.24，P ＜0.05）；MDA-MB-231細胞與MCF-7結果一致（F=564.18，P＜0.05），見表1、圖11。

Table 1 Comparison of the wound healing ability of breast cancer cells between three groups表1 3組乳腺癌細胞劃痕的愈合率比較 （±s）

Table 1 Comparison of the wound healing ability of breast cancer cells between three groups表1 3組乳腺癌細胞劃痕的愈合率比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與（3）組比較，P ＜ 0.05

組別MOCK組（1）NC組（2）miR-30d ASO組（3）F n333 MCF-7細胞0.55±0.09a0.59±0.08a0.23±0.03 743.24＊＊MDA-MB-231細胞0.61±0.11a0.67±0.09a0.15±0.02 564.18＊＊

Figure 11 Comparison of the wound healing ability between three groups圖11 3組細胞的劃痕愈合能力比較

2.6 抑制miR-30d的表達對MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響 對于MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞，miR-30d ASO組的MMP-2和MMP-9相對表達量明顯低于MOCK組和NC組（P ＜0.05），見表2、圖12。

Table 2 Comparison of the expression levels of MMP-2 and MMP-9 between three groups表2 各組細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達水平比較（n=3±s）

Table 2 Comparison of the expression levels of MMP-2 and MMP-9 between three groups表2 各組細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達水平比較（n=3±s）

＊＊P ＜ 0.01；a與（3）組比較，P ＜ 0.05

組別MOCK組（1）NC組（2）miR-30d ASO組（3）F MCF-7細胞MMP-2蛋白0.43±0.05a0.46±0.08a0.12±0.01 73.80＊＊MMP-9蛋白0.54±0.10a0.58±0.09a0.23±0.04 112.66＊＊MDA-MB-231細胞MMP-2蛋白0.39±0.11a0.40±0.10a0.19±0.04 38.61＊＊MMP-9蛋白0.79±0.18a0.88±0.15a0.14±0.03 141.27＊＊

Figure 12 The expression levels of MMP-2 and MMP-9 in three groups圖12 MMP-2和MMP-9蛋白在3組細胞中的表達情況

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全球每年約有120萬婦女發生乳腺癌。近年，我國乳腺癌的發病率呈逐年上升趨勢，死亡率居女性惡性腫瘤首位。隨著分子生物學的發展，發現人體內基因的表達異常與腫瘤的發生、發展密切相關，腫瘤的基因治療成為近年來研究的熱點。目前研究證明,miRNA分子調控了人類基因組內約1/3的基因表達[6]，如何對調控腫瘤基因表達的特異性miRNA分子進行調節備受關注。

MicroRNAs是一類新的基因調節因子，其在控制細胞的生長、發育、分化、新生血管形成和凋亡等生物學過程中發揮著非常重要的作用[7]。研究發現miRNAs與癌癥的發生及侵襲轉移關聯緊密[8-9]。因此miRNAs有可能成為診斷惡性腫瘤的分子標志和判斷腫瘤侵襲轉移及預后的分子靶點，此外miRNAs在轉錄后水平調節其靶基因的表達，這將更有助于癌癥的早期發現、早期診斷和早期治療，其必將具有非常廣闊的臨床應用前景[10]。

本研究首先利用實時熒光定量PCR檢測臨床乳腺癌標本及相對應的正常癌旁組織，結果發現miR-30d在乳腺癌組織中呈明顯高表達，表明miR-30d可能在乳腺癌發生發展過程中發揮重要作用。有研究報道miR-30d過表達可以促進肝癌細胞侵襲轉移[5]。為了證實miR-30d在乳腺癌細胞侵襲遷移中是否發揮相同的功能，本研究首先通過轉染miR-30d ASO降低乳腺癌細胞中miR-30d的表達，同時利用Transwell方法檢測降低miR-30d的表達后乳腺癌細胞侵襲遷移能力的變化，結果顯示轉染miR-30d ASO的乳腺癌細胞侵襲遷移能力明顯降低，劃痕實驗結果顯示抑制miR-30d的表達后，乳腺癌細胞的劃痕愈合能力明顯下調。這些結果表明miR-30d在乳腺癌細胞的侵襲遷移過程中起著非常重要的作用。

MMPs是一類主要降解細胞外基質（ECM）成分的蛋白酶，腫瘤從原位增殖到浸潤轉移的演進過程中必須具備降解ECM的能力。MMPs幾乎能降解ECM中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲轉中起關鍵作用。目前MMPs家族已分離鑒別出26個成員，編號分別為MMP1～26。研究證實MMP-2和MMP-9蛋白與腫瘤的侵襲轉移密切相關[11-12]。本研究發現抑制miR-30d的表達可以明顯降低侵襲相關蛋白MMP-2和MMP-9的表達，說明miR-30d可能是通過調控MMP-2和MMP-9的表達而對腫瘤細胞侵襲遷移產生影響。

綜上，miR-30d在調控乳腺癌細胞的侵襲和遷移方面發揮重要作用，其可能是一個新的乳腺癌侵襲轉移調節基因，是乳腺癌基因治療的新靶點。

Figure 4 Comparison of the invasion ability of MCF-7 cells between three groups圖4 3組MCF-7細胞的Transwell侵襲實驗結果

Figure 6 Comparison of the invasion ability of MDA-MB-231 cells between three groups圖6 3組MDA-MB-231細胞的Transwell侵襲實驗結果

Figure 8 Comparison of the migration ability of MCF-7 cells between three groups圖8 3組MCF-7細胞的Transwell遷移實驗結果

Figure 10 Comparison of the migration ability of MDA-MB-231 cells between three groups圖10 3組MDA-MB-231細胞的Transwell遷移實驗結果

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（2013-06-05收稿 2013-10-15修回）

（本文編輯 閆娟）

The Effect of Antisense miR-30d on Invasion and Migration in Breast Cancer Cells

CHEN Ge,LUO Ping,GONG Yu,ZHOU Yao,ZHAO Ruijun,XIE Chunwei
Department of Breast Surgery,The Third Hospital of Nanchang City，Nanchang 330009,China

ObjectiveTo investigate the expression of miR-30d in breast cancer tissues and demonstrate the regulative effects of miR-30d ASO on the invasion and migration of breast cancer cells in vitro.MethodsThe expression levels of miR-30d in 108 breast cancer tissues and their adjacent tissues were detected by real-time quantitative PCR method.After transfection with miR-30d ASO,the biological effects of miR-30d on in breast cancer cells was measured by transwell assay and wound healing assay.The expressions of matrix metalloproteinase(MMP)-2 and MMP-9 were analyzed by Western blot assay.ResultsThe expression level of miR-30d was found to be over-expressed in breast cancer tissues(P＜0.05).Compared with control group and nonsense interference group,the miR-30d expression was significantly decreased in breast cancer cells（transfection with miR-30d ASO).Results of transwell and wound healing assay showed that the invasion and migration ability decreased significantly after transfection with miR-30d ASO,and expressions of MMP-2 and MMP-9 were down-regulated(P＜0.05).ConclusionmiR-30d was over-expressed in human breast cancer.The invasion and migration of breast cancer cells can be effectively inhibited by decreasing the expression of miR-30d.miR-30d may become a new target for the regulation of invasion and migration in breast cancer.

breastneoplasms；carcinoma；neoplasm invasiveness；cell movement；miR-30d;antisenseoligonucleotides

R735.7 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.004

南昌市第三醫院乳腺外科（郵編330009）

△通訊作者 E-mail：lufen6677@163.com