骨保護素基因單核苷酸多態性與類風濕關節炎發病的相關性研究*

蔡月明， 龍 霞， 王慶文， 王 菁， 吳志成， 王偉光， 曾慧萍， 張 璐

(北京大學深圳醫院 1風濕免疫科, 2中心實驗室, 3安徽醫科大學北京大學深圳醫院臨床學院, 4檢驗科，廣東 深圳 518036)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性全身性自身免疫性疾病，以關節持續的滑膜炎、明顯的炎癥細胞浸潤、關節液致炎癥因子劇增和侵襲性新生血管翳形成為特點，晚期往往會引起嚴重的關節畸形和活動障礙，甚至殘疾，給病人生活、工作造成極大痛苦，同時給病人家庭和社會帶來巨大的負擔[1-2]。RA確切病因尚未完全闡明。但RA常在早期即可出現患病關節骨質疏松以及骨與軟骨的骨質破壞，目前已經明確破骨細胞是導致RA發病過程中多關節進行性軟骨和骨質侵蝕破壞、骨礦物質溶解丟失的重要參與者。大量研究[ 3-4 ]證實，骨保護素(osteoprotegerin, OPG)/核因子κB受體激活因子(receptor activator of NF-κB, RANK)/核因子κB受體激活因子配體(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)系統是調節破骨細胞分化、成熟和凋亡最重要的信號通路。近年來，一些研究發現，OPG/RANK/RANKL系統單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)與骨代謝更新、骨侵蝕及骨礦物質溶解丟失相關，并在骨質疏松[5]、骨髓瘤[6]、心血管疾病[7]、腫瘤[8]、缺血性腦卒中[9]中做了研究探索，但與RA的關聯性研究較少。本研究擬通過比較OPG的基因多態性163A/G(rs3102735)及245T/G(rs3134069)在中國漢族RA人群與健康對照人群的不同分布，對OPG的基因多態性與RA發病的關系進行探討。

材 料 和 方 法

1 研究對象

376例研究對象血樣取自2010年8月至2011年9月門診及住院的RA病人及同期進行健康體檢的人群。其中健康對照組171人，RA組205人。健康對照組男74人(43.3%)，女97人(56.7%)，年齡22～81歲，平均(41.6±11.2)歲。 RA組男30人(14.6%)，女175人(85.4%)，年齡14～81歲，平均(48.5±14.5)歲。研究個體均為中國漢族人，無血緣關系。

RA診斷符合美國風濕病學會1987年RA分類標準。記錄患者的臨床資料，包括癥狀、體征、實驗室檢查及治療情況。患者定期隨診，每2周～1個月監測1次血常規、肝腎功能變化。觀察半年內病情變化情況。

2 主要試劑

PCR擴增儀(Eppendorf Mastercycler Gradient)；低溫高速離心機(Thremo Scientific Heraeus Multifuge)；恒溫加熱器(TU-10，上海滬粵明科學儀器有限公司 )；電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設備有限公司)；水平電泳系統和凝膠成像系統(Bior-Rad)；DNA序列合成(南京金斯瑞)；基因組DNA提取試劑盒(Blood Genome DNA Extraction Kit)和PCR擴增試劑盒(Premix Taq Version 2.0)購自大連寶生物公司；DNA Marker(Tiangen)；AseI和HinfI內切酶購自NEB。

3 主要方法

3.1DNA模板的制備 取研究對象外周靜脈血2 mL，枸櫞酸鈉抗凝，用Blood Genome DNA Extraction Kit提取DNA，按說明書進行操作。

3.2擴增引物設計 以Primer 5軟件并參考文獻[10]設計擴增模板的引物，設計后經過BLAST比對分析。上游引物5’-CTGGAGACATATAACTTGAACA-3’，下游引物5’-CCATCATCAAAGGGCTATTGGT-3’，產物長度為300 bp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

3.3PCR反應體系與條件 用Eppendorf Mastercycler gradient PCR擴增儀，采用TaKaRa的Premix Taq Version 2.0反應試劑盒進行PCR擴增：反應總體積30 μL，含1 μg基因組DNA，Premix Taq(dNTP 20 μmol/L，耐高溫TaqDNA聚合酶0.75 U，MgCl21.5 mmol/L)15 μL,上、下游引物各2.0 μL(5 pmol/μL)，ddH2O 8 μL，總體積30 μL。擴增條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴增40個循環，最后72 ℃終末延伸10 min。PCR反應完成后，取5 μL產物，用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，80 V電壓，50 min，凝膠成像儀下觀察結果并照相保存圖像。

3.4限制性核酸內切酶酶切檢測基因型 取PCR擴增產物分2管，每管各10 μL，分別加入相應緩沖液2 μL，ddH2O 7 μL，其中一管加入OPG 163A/G位點的限制性核酸內切酶AseI 5 U，另一管加245T/G位點的限制性核酸內切酶HinfI 5 U，每管總體積為20 μL，在37 ℃恒溫下水浴消化5～15 min，加入6×loading buffer 4 μL終止酶切反應。取酶切產物用2%瓊脂糖凝膠(含0.5 g/L溴化乙啶)，70 V電壓電泳60 min，凝膠成像儀下觀察結果并照相保存圖像。

4 統計學處理

結 果

1 RA組臨床特征

研究納入RA患者205人，男30人(14.6%)，女175人(85.4%)，年齡14～81歲，平均(48.5±14.5)歲，病程平均(15.4±10.2)月，超敏C反應蛋白(high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)平均(11.5±22.6) mg/L，類風濕因子(rheumatoid factor,RF)平均(40.6±20.3) IU/L，血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)平均(41.5±19.8) mm/h，腫脹關節數平均(3.67±4.52)個，疼痛關節數平均(12.08±8.52)個。

2 OPG基因 163A/G及 245T/G 位點PCR擴增結果及酶切結果

以外周血基因組DNA為模板，用合成的引物進行OPG基因PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增的PCR產物為300 bp，OPG163A/G位點在內切酶AseI 的作用下分解為161 bp 和139 bp 2個片段，AA為純合子顯示2條帶(161 bp和139 bp)，GG為純合子僅1條帶(300 bp)，AG為雜合子顯示3條帶(300 bp、161 bp和139 bp)；245T/G位點在內切酶HinfI 的作用下分解為245 bp 和55 bp 2個片段，GG為純合子(245 bp和55 bp)，TT為純合子(300 bp)，TG為雜合子(300 bp、245 bp和55 bp)。電泳圖中55 bp不顯影，見圖1、2。

Figure 1. PCR amplication result of 163A/G locus in OPG gene and the result of Ase I enzyme digestion.Lane 1: 163GG; Lane 2: 163AG; Lane 3: 163AA.

Figure 2. PCR amplication result of 245T/G locus in OPG gene and the result of Hinf I enzyme digestion.Lane 1: 245TT; Lane 2: 245TG; Lane 3: 245GG.

3 基因型和等位基因的分布

RA組OPG基因163A/G基因型頻率分別是AA 62.0%、AG 30.7%和GG 7.3%，野生型等位基因A 77.3%，突變型等位基因G 22.7%，對照組分別是AA 69.6%、AG 28.7%和GG 1.8%,等位基因分別為A 83.9%和G 16.1%，2組比較差異有統計學意義(2=6.993，P<0.05)。比較2組人群各基因型的分布，結果顯示GG基因型在2組有顯著差異(2=6.329，P<0.05)，AA基因型及AG基因型均未見顯著差異(分別為2=2.405及2=0.192，P>0.05)。245T/G在2組的比較差異無統計學意義(P>0.05)，分別為RA組TT 86.3%、TG 13.2%和GG 0.5%，對照組TT 84.2%、TG 14.6%和GG 1.2%。等位基因的比較亦未見顯著差異(P>0.05)，分別為RA組T 93.0%和G 7.0%,對照組T 91.5%和G 8.5%。這表明OPG基因163A/G單核苷酸多態性與我國漢族人群RA發病可能相關聯，但245T/G與發病無明顯相關性,見表1、2。

4 OPG 163A/G及 245T/G基因連鎖不平衡分析

根據連鎖不平衡分析，rs3102735和rs3134069存在不完全連鎖，LOD=1，R2=0.14。

5 163A/G及245T/G多態性與疾病的關聯性分析

建立多因素Logistic回歸模型，調整年齡、性別、病程、RF、ESR、hs-CRP和腫痛關節數后，OPG163G等位基因患RA的OR為1.219(95% CI：1.066～2.339，P<0.05),表明攜帶OPG163G基因型者患病危險性是非攜帶者的1.219倍。245T/G未被納入回歸方程,表明與RA無明確關系。

表1 OPG 163A/G基因型在RA組和對照組中的分布

表2 OPG 245T/G基因型在RA組和對照組中的分布

討 論

RA發病機制紛繁復雜，涉及基因與環境多種因素，確切機制目前仍不完全清楚。針對RA發病機制中骨質疏松以及骨與軟骨破壞的研究發現提示可能與OPG/RANK/RANKL系統相關。而正常骨重建過程包括成骨細胞骨形成與破骨細胞骨吸收，兩者維持體內骨代謝的動態平衡。OPG/RANKL系統調節破骨細胞的分化、成熟及病理狀態下的骨質流失。在炎癥因子刺激下，RA關節周圍組織能表達RANKL，且能提供破骨細胞前體細胞。RANKL與表達于破骨細胞前體細胞胞膜上的受體RANK結合，通過調控破骨細胞分化、成熟并抑制其凋亡，對RA骨質溶解、軟骨破壞等過程發揮極為重要的調控作用，而OPG通過拮抗RANKL發揮作用[11]。

OPG是腫瘤壞死因子受體家族成員，人類OPG基因位于染色體8q23～24，OPG蛋白由401個氨基酸殘基組成，常以同二聚體形式分泌到胞外。OPG在人體的骨組織中有較高表達，主要由成骨細胞及骨髓基質細胞分泌。在骨組織中，OPG作為一種誘餌受體，能與RANKL或腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)競爭性結合，以阻斷RANKL與RANK結合，發揮抑制破骨細胞分化、成熟，誘導破骨細胞凋亡的作用[12]。針對OPG/RANK/RANKL系統在RA發病過程的候選基因關聯分析和全基因組SNPs掃描，被用來研究RA的遺傳學成因，發現了一些與RA相關的基因位點。這就更進一步證實OPG/RANK/RANKL系統與RA關系密切。

本研究選取的163A/G和245T/G位于OPG基因啟動子區。通過病例-對照研究遺傳流行病學的關聯分析結果顯示，OPG163A/G基因型頻率和等位基因頻率2組比較差異有統計學意義，但245T/G在2組之間的差異無統計學意義，表明OPG基因163A/G單核苷酸多態性與我國漢族人群RA發病相關，但245T/G與發病無明顯相關性。建立多因素回歸模型，調整其它調查因素年齡、性別、病程、RF、ESR、hs-CRP、腫痛關節數后，OPG163GG型患RA的OR為1.219，進一步證明163A/G單核苷酸多態性與我國漢族人群RA發病相關。目前國內尚無OPG多態性與RA相關性的研究報道。

Hussien等[13]在埃及人群中的調查認為，OPG163A/G與RA易感性相關，并且與RA患者的骨質疏松相關，是RA患者中骨質疏松的重要參與因素。 相反的，Assmann等[14]在RA患者與健康對照者所做的病例對照研究中，對RANK、RANKL和OPG的7 個SNPs包括RANKrs1805034、rs35211496、OPGrs3102735、rs2073618以及RANKLrs9533156、rs2277438、rs1054016 進行了分析，并未發現OPGrs3102735、rs2073618與RA相關。Furuya等[15]研究了RA患者OPG的2個SNPs rs2073617和rs2073618位點，未發現在日本人群中與RA的發病及影像學進展有關聯。但Masi等[16]對癥狀出現1年以內、影像學表現2年以內的早期RA的研究表明，雖未發現RA與OPGRsaI限制性酶切多態性的相關性，但認為此SNP與手影像學骨侵蝕相關。2013年，Guo等[17]對OPG相關文章做了薈萃分析，表明 A163G多態性與白種人骨質疏松風險相關，而G1181C多態性的C等位基因則可降低骨質疏松風險，尤其在亞洲絕經后女性中更加明顯。

多項研究已經表明OPG基因與骨密度相關。而針對OPGSNPs是否影響骨代謝更新和骨礦物質密度，Choi等[ 18 ]的研究發現，OPGSNPs 163A/G與1181G/C與韓國女性絕經后骨礦物質密度降低有一定相關性，尤其是當同時存在RANK575TT基因型時。Yu等[19]檢測了OPG基因18861A>G及25548C>T這2個SNPs，認為18861A>G基因型與中國絕經后婦女脊柱、股骨頸及全髖骨礦物質密度降低相關，與骨質疏松具有關聯性。Kim等[ 20 ]研究認為OPGG1181C SNP單獨或與RANKLrs2277438 SNP同時存在可作為判斷韓國婦女腰椎骨礦物質密度的重要相關遺傳因子。

由于目前國內對于OPG/RANK/RANKL系統 SNP與RA的研究尚不多見。本文對OPG基因與RA的關系進行了初步探討。但由于研究人群數量有限，故進一步的驗證尚需多中心和大樣本的研究。

[參 考 文 獻]

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