劉艷娟， 周 斌， 蔣碧梅， 童中藝， 孫 麗， 李媛彬， 肖獻忠

(中南大學湘雅醫學院病理生理教研室，湖南 長沙 410078)

核仁素(nucleolin， Ncl)是目前發現的271種核仁蛋白質中含量最多的一種,約占核仁蛋白質總量的10%[1],是細胞內一個非常重要的具有多功能的穿梭蛋白。研究表明,核仁素具有多種生物學功能,如調控核糖體的生物合成與成熟，調控細胞增殖、生長、胚胎發生、胞質分裂、染色質復制與核仁的發生等過程[2-5]。本實驗室前期工作中發現氧化應激導致的心肌細胞及內皮細胞發生凋亡時伴有核仁素的斷裂及表達下調[6-7]；核仁素過表達則可明顯增強心肌細胞的抗損傷能力[8]。目前已有研究使用轉基因小鼠進行整體水平實驗[9]，但現階段對核仁素的心肌保護作用及其機制的研究往往只局限于細胞水平，缺乏整體水平證據。本研究建立并鑒定了攜帶有外源核仁素基因的轉基因小鼠, 為從整體水平上研究核仁素對心肌功能的影響, 并為其發揮心肌保護作用的機制研究提供動物模型。

材 料 和 方 法

1 材料

H9C2細胞(大鼠心肌細胞株)由本校細胞中心提供。pcDNA3.l質粒為我科室保存,含α-肌球蛋白重鏈(α-myosin heavy chain, α-MyHC)啟動子的質粒Alpha-MyHC clone 26為南京大學模式動物研究中心饋贈。C57BL/6小鼠購買于南京大學模式動物研究中心。GAPDH單克隆抗體購于Cell Signaling。兔抗核仁素單克隆抗體購于Sigma-Aldrich。辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠、山羊抗兔均購自Boster Biological Technology。

2 方法

2.1質粒 Alpha-MyHC clone 26-Ncl的建立 提取小鼠心臟總RNA，用 RT-PCR 擴增小鼠Ncl全長cDNA，將擴增片段插入 pcDNA3.1 載體，經測序并比對正確無突變堿基后，以SalI內切酶酶切，回收Ncl片段，并克隆入α-MyHC啟動子下游構建心臟特異性核仁素表達載體(Alpha-MyHC clone 26-Ncl)，挑取抗氨芐青霉素的陽性克隆菌并擴增后，用小量質粒DNA提取試劑盒抽提質粒。一部分采用SalI內切酶進行酶切鑒定，一部分測序鑒定。

2.2心臟特異性高表達核仁素轉基因小鼠的建立 此工作委托南京大學模式動物研究中心完成。將Alpha-MyHC clone 26-Ncl 質粒采用顯微注射的方法注入小鼠受精卵雄性原核,將注射后的受精卵移植入假孕小鼠輸卵管內,獲得首建小鼠。

2.3轉基因小鼠基因型的鑒定 剪取5 mm小鼠尾巴，提取尾巴組織DNA，并委托上海生物工程技術服務有限公司設計并合成核仁素PCR擴增引物，上游引物5’-AGTGAGGAAGATGCCAAAGC-3’,下游引物5’-GAAGGACACCTAGTCAGACA-3’。再以提取的小鼠尾巴組織DNA為模板進行PCR擴增反應，PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,溴化乙啶染色后于紫外透射儀攝像。

2.4Western blotting法檢測各組織中Ncl的表達 分別取轉基因小鼠的肝、腎、腦、心臟組織，提取各組織中的蛋白后用BCA法測蛋白濃度，取30 μg蛋白裂解液經12% SDS-PAGE電泳分離，電轉移法將膠上蛋白轉至PVDF膜上，用封閉緩沖液室溫下封閉4 h，然后加入兔Ncl單克隆抗體(1∶1 000稀釋)于搖床上,室溫下反應2 h。用洗膜液洗去I抗后,加入辣根過氧化物酶偶聯的抗兔IgG II抗(1∶1 000稀釋)于搖床上,反應1 h后,洗膜液洗去Ⅱ抗。用DAB顯色,進行灰度掃描及定量分析。

3 統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件處理,數據以均數±標準差(mean±SD)表示,多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 小鼠核仁素基因的心肌特異性表達質粒Alpha-MyHC clone 26-Ncl的建立與鑒定

為了構建心肌特異性高表達核仁素的轉基因小鼠,我們首先采用SalⅠ內切酶分別酶切pcDNA3.1-Ncl和Alpha-MyHC clone 26質粒，再采用基因重組的方法,將小鼠核仁素基因插入至心肌特異性表達載體Alpha-MyHC clone 26)中，構建含小鼠核仁素基因的心肌特異性表達質粒Alpha-MyHC clone 26-Ncl，分別采用NotI和SalI進行酶切鑒定，結果顯示SalI酶切后產生了一條約2.1 kb大小的片段，而NotI酶切后出現一條約3 kb大小的片段，與預期結果相符 (圖1A)，進一步測序鑒定其序列的正確性(圖1B)。上述結果提示含有小鼠核仁素基因的心肌特異性表達質粒Alpha-MyHC clone 26-Ncl構建成功。

2 心肌特異性高表達核仁素轉基因小鼠的鑒定

剪取少許小鼠尾巴提取組織DNA,采用PCR方法鑒定首建鼠(F0代)基因型,發現共有4只首建鼠為陽性小鼠,分別為51號、52號、56號和86號。其中首建鼠52號和86號繁殖良好,并保留有核仁素高表達特性。目前為止共繁殖到F6代。圖2顯示部分首建鼠基因鑒定結果。

Figure 1. Identification of myocardium-specific nucleolin-expressing plasmid (Alpha-MyHC clone 26-Ncl) by restriction enzyme digestion (A) and sequencing (B). M: DNA marker; 1: without digestion; 2: digested by Not I; 3: digested by Sal I.

Figure 2. Identification of the founders by PCR.M: DNA mar-ker; P: positive control; B6: wild-type mice; N: negative control.

3 轉基因小鼠心肌中核仁素的表達情況

分別剪取轉基因小鼠與野生型小鼠心肌、肝、肺、腎和腦組織,提取組織蛋白后,采用Western blotting檢測核仁素蛋白表達水平。結果顯示,核仁素在轉基因小鼠心肌組織中特異性高表達,轉基因小鼠心肌組織中核仁素蛋白水平明顯高于野生型小鼠(圖3),其中52系首建鼠子代心肌組織內核仁素表達量約為野生型2.05倍,86系首建鼠子代心肌組織內核仁素表達量約為野生型3.61倍。

4 心肌特異性高表達核仁素對小鼠心臟重量指數(heart weight index，HWI)、心功能及心肌形態學的影響

分別稱取轉基因小鼠與野生型小鼠的體重與心臟重量，計算HWI(心臟重量/體重)。經統計學分析發現心臟體重指數未見明顯差別，見圖4A。采用PowerLab裝置檢測血流動力學參數，發現兩者無明顯差別，見圖4B。收集各組的心肌組織,進行石蠟包埋、切片、HE染色,于顯微鏡下觀察,發現兩者心肌組織形態無明顯差異,見圖4C。這些結果表明，與野生型小鼠相比，核仁素轉基因小鼠的心臟大小、心臟功能和心肌細胞形態無明顯變化。

Figure 3. The expression of nucleolin (Ncl) protein in the myocardium and other tissues measured by Western blotting. A: expression of Ncl protein in cardiac tissues of transgenic (TG) and wild-type (WT) mice; B: expression of Ncl in myocardium and other tissues in transgenic mice (86 line). Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs WT; #P<0.05 vs liver, lung, kidney or brain.

Figure 4. The effects of nucleolin overexpression on heart weight index (HWI; A)， left ventricular pressure maximum rise rate (LV+dp/dtmax； B)and myocardial morphology (C; HE staining,×200) in transgenic mice.Mean±SD.n=6.

討 論

核仁素作為細胞核仁中含量最豐富的磷酸蛋白具有多種生物學功能。本實驗室前期工作中發現核仁素表達下調能觸發心肌細胞凋亡，過表達則可明顯增強心肌細胞的抗損傷能力[8],核仁素還可通過與HSP70 mRNA的 3’UTR 相結合, 增強 HSP70 mRNA 的穩定性, 上調HSP70的表達,進而在心肌缺血預適應中起作用[10]。整體動物水平實驗發現，核仁素能調控熱休克蛋白32的表達進而在心肌缺血再灌注誘導的心肌損傷中起保護作用[11]。但核仁素在整體動物水平是否起保護作用，目前尚不十分清楚。為了解決此問題，本研究構建了具有表達核仁素能力的真核質粒，然后用該序列構建帶有心肌細胞特異性啟動子的心肌細胞核仁素表達質粒，成功制備了轉基因小鼠。

本實驗中轉基因小鼠的構建利用原核顯微注射法，即將基因(真核表達質粒)注射到受精卵的雄性原核。該表達質粒的構建分兩步實現：首先，以pcDNA3.1質粒為載體，插入小鼠核仁素表達序列，構建成pcDNA3.1-Ncl；其次,將pcDNA3.1-Ncl中的核仁素序列插入到Alpha-MyHC clone 26質粒中Alpha-MyHC啟動子下游，構成Alpha-MyHC clone 26-Ncl心肌細胞特異性表達核仁素質粒。再利用其核仁素全長cDNA基因構建Alpha-MyHC clone 26-Ncl表達質粒，并以此進行顯微注射，從而制備了核仁素的轉基因小鼠。采用Western blotting方法觀察到轉基因小鼠心肌中核仁素表達量明顯高于野生鼠；與野生型小鼠相比較，心肌中核仁素過表達對小鼠的心臟、心肌形態學改變及心功能改變無明顯影響，提示心肌特異性高表達核仁素轉基因小鼠構建成功。

本研究制備的心肌特異性表達核仁素的轉基因小鼠，可作為整體動物模型用于核仁素蛋白的心肌保護作用及機制的研究，也可用于其它心血管疾病的研究。

[參 考 文 獻]

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