林 娜， 左婉紅， 賴周毅， 伍嘉寶， 陳美苑， 汪 源， 陳麗新△， 王立偉△

(暨南大學醫學院 1生理學系， 2藥理學系，廣東 廣州 510632)

乙醇是酒的主要成分，近年的研究表明，飲酒與多種惡性腫瘤發生發展密切相關[1-3]，鼻咽癌是我國華南地區的高發腫瘤，流行病學顯示飲酒和人類鼻咽癌的發生具有相關性[3]，但其確切機制并不明了。氯通道在多種細胞中廣泛表達，并且我們前文中報道容積敏感性氯通道在腫瘤細胞的增殖、遷移、凋亡和容積調節等過程中發揮重要的作用[4-8]。目前國內外研究乙醇和離子通道的關系主要為陽離子通道，對陰離子通道的報道較少。本實驗通過膜片鉗技術觀察乙醇對CNE-2Z細胞氯通道的影響。ClC-3蛋白被認為是容積敏感性氯通道重要的候選蛋白之一，利用siRNA干擾技術沉默ClC-3氯通道探討乙醇誘導氯電流性質的改變，進一步分析其電流的分子本質，更好地了解和闡明乙醇影響腫瘤細胞惡性生物學行為的機制，為鼻咽癌惡性腫瘤的治療提供新的靶標和生物學干預手段。

材 料 和 方 法

1 細胞培養

低分化鼻咽癌CNE-2Z細胞培養于含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的RPM I-1640 培養基、37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養箱內，用0.25%胰酶和0.02% EDTA隔天傳代。

2 膜片鉗實驗

2.1電極內液、灌流液、氯通道阻斷劑 電極內液(mmol/L)含70 N-methyl-D-glucamine chloride (NMDG-Cl)、1.2 MgCl2、10 HEPES、1 EGTA、140 D-mannitol和2 ATP，調pH值至7.25，實驗前加入ATP。等滲液(mmol/L)含70 NaCl、0.5 MgCl2、2 CaCl2、10 HEPES和140 D-mannitol。47%高滲液含280 D-mannitol,其它成分同等滲液。調pH值至7.4,冰點滲透壓計檢測滲透壓分別為300和440 mOsmol/L。氯通道阻斷劑5-硝基-2-(3-苯丙胺基)苯甲酸[5-nitro-2-(3-phenylpropylamino) benzoic acid, NPPB] (Sigma)用DMSO配成100 mmol/L的儲存液，用前用灌流液稀釋至100 μmol/L。

2.2全細胞膜片鉗記錄 胰酶消化細胞貼于22 mm玻片上，1 h后從培養箱中取出，貼于灌流槽內。用EPC-7膜片鉗放大器在全細胞電壓鉗制模式下記錄全細胞電流，鉗制細胞在0、±40 mV、±80 mV往復循環，每個鉗制脈沖波寬200 ms，間隔為4 s。用等滲灌流穩定3～5 min，記錄穩定的基礎電流，加入不同濃度乙醇，待電流達到穩定的峰值，加入高滲或氯通道阻斷劑分析乙醇激活電流的生理學及藥理學特性。

2.3高滲及氯通道阻斷劑抑制全細胞電流 待激活電流達到高峰穩定3 min加入含相應濃度乙醇的47%高滲溶液或氯通道阻斷劑NPPB。抑制率(%)的計算公式為[(CEtOH-CIso)-(Cblock- CIso)]/(CEtOH-CIso)×100%。其中CIso、CEtOH、Cblock分別為±80 mV電壓鉗制下等滲、乙醇、乙醇加高滲或阻斷劑時的電流值。

3 siRNA干擾ClC-3基因的表達

ClC-3 siRNA雙鏈正義鏈序列5’-CAAUGGAUUUCCUGUCAUATT-3’，反義鏈序列5’-UAUGACAGGAAAUCCAUUGTA-3’；對照組無序siRNA正義鏈序列5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈序列5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。siRNA標記有5-FAM熒光基團。參考我們以前發表的方法[9]，對細胞進行轉染。轉染細胞6 h后在熒光顯微鏡下檢測轉染效果。48 h后消化細胞并貼片，在熒光顯微鏡下選取帶熒光(siRNA轉染成功)的細胞進行全細胞膜片鉗實驗。灌流乙醇，觀察激活氯通道的情況，分析該電流特性的改變。

4 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示,用SPSS 13.0軟件處理,采用F檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同濃度乙醇激活CNE-2Z細胞氯電流

當CNE-2Z細胞浸浴在等滲灌流液中，細胞電流小而穩定。待穩定3 min后在等滲灌流液中加入不同濃度的乙醇(0.17、1.7、17、85和170 mmol/L)灌流細胞,激活的電流具有濃度依賴性，+80 mV鉗制電壓下激活的電流密度呈倒U型，17 mmol/L乙醇激活的電流密度達到峰值，見圖1。

Figure 1. The chloride current activated by ethanol with different concentration at ±80 mV in CNE-2Z cells.Mean±SD.n=5.**P<0.01 vs control group.

2 乙醇誘導CNE-2Z細胞氯電流的容積敏感性

如圖2所示，在+80 mV和-80 mV電壓鉗制下背景電流穩定而微弱，待電流穩定3 min后細胞外灌流17 mmol/L乙醇后，內外向電流均明顯增大呈較明顯的外向優勢，在±80 mV無明顯的電壓依賴性失活，翻轉電位是(-4.4±3.7)mV,接近氯離子的平衡電位-0.9 mV。穩定后，胞外灌流47%高滲溶液，內外向電流均受到明顯抑制(P<0.01)，高滲液對內外向電流的抑制率間沒有顯著差異(P>0.05)。

Figure 2. The ethanol-induced chloride current and inhibition of the current by hypertonicity in CNE-2Z cells. A: the typical course of current recordings; B: the inhibition ratio of the current by hypertonicity at ±80 mV.Mean±SD.n=9.

當乙醇(17 mmol/L)激活的電流達高峰并平穩后，用相同濃度的葡萄糖酸鈉替代灌流液中的氯化鈉(70 mmol/L)，即用葡萄糖酸根離子置換氯離子。結果顯示，乙醇激活的電流明顯減弱，+80mV時的電流密度減少了75.5%±1.5% (P<0.01)，翻轉電位由(-4.4±3.7)mV變為(18.2±1.9)mV。

3 氯通道阻斷劑抑制乙醇誘導的CNE-2Z細胞氯電流

利用氯通道阻斷劑NPPB觀察該電流的藥理學特性。待乙醇激活的氯電流達到高峰穩定3 min后加入100 μmol/L NPPB可見內外向電流均被明顯抑制(P<0.01)。

Figure 3. The ethanol-induced chloride current and inhibition of the current by the chloride channel blocker NPPB in CNE-2Z cells. A： the typical course of current recordings; B: the inhibition of the ethanol-induced chloride currents by NPPB at ±80 mV.Mean±SD.n=5.

4 沉默ClC-3氯通道的表達對乙醇誘導電流的影響

4.1熒光顯微鏡檢測轉染效果 利用siRNA技術干擾ClC-3氯通道基因的表達，轉染細胞6 h后在熒光顯微鏡下觀察轉染效果，圖4所示ClC-3 siRNA已被成功轉染到CNE-2Z細胞。圖4A是明場拍攝條件下的細胞形態，圖4B是轉染ClC-3 siRNA的熒光圖像，圖4C是不加ClC-3 siRNA的對照組熒光圖像(其明場拍攝條件下的細胞形態未顯示)。結果顯示，轉染組的大部分細胞可檢測到熒光，而對照組則無熒光。

Figure 4. Inhibition of ethanol-induced chloride currents by ClC-3 siRNA. A～C: transfection efficiency of ClC-3 siRNA detected by the fluorescence microscope; D: I-V relationships. Mean±SD.n=14.**P<0.01 vs ethanol (control) group.

4.2膜片鉗記錄轉染ClC-3 siRNA后乙醇激活的氯電流 成功轉染細胞48 h后進行膜片鉗實驗，按照上述方法，用膜片鉗記錄等滲液中CNE-2Z細胞的氯電流。背景氯電流穩定而微弱， 待其穩定3 min灌流17 mmol/L乙醇，達到峰值穩定3 min，灌流高滲或氯通道阻斷劑。記錄細胞的I-V曲線。與未經ClC-3 siRNA處理的CNE-2Z細胞相比，乙醇激活的氯電流密度明顯減小，見圖4D(P<0.01)。

討 論

目前認為乙醇與多種惡性腫瘤的發生關系密切，以消化系統腫瘤如口、咽喉、食管、肝、胃、結直腸等部位的腫瘤和乳腺癌、肺癌、前列腺癌多見[2]。鼻咽癌是我國華南地區的高發惡性腫瘤，由于鼻咽解剖位置較深,結構復雜, 并且以非角化型未分化癌為主,極易發生頸部淋巴結和遠處轉移，嚴重影響病人生存。近年來流行病學調查及動物學實驗結果表明，酗酒與鼻咽癌呈正性相關[3]，因此探討其本質顯得尤為重要。

本研究表明，乙醇可以激活一個較大的電流，此電流的翻轉電位接近氯離子平衡電位，用葡萄糖酸根離子替代溶液中的氯離子可以抑制該電流，并使翻轉電位遠離氯離子的平衡電位，表明此電流主要是由氯離子介導，即一定劑量的乙醇可以激活鼻咽癌細胞的氯通道，并且結果還提示，乙醇敏感的氯通道對葡萄糖酸根離子也有一定的通透性。人血液中乙醇濃度達17 mmol/L是臨床上表現為急性乙醇中毒的臨界值，本實驗中此濃度的乙醇在低分化鼻咽癌細胞上激活一氯電流，并能夠被氯通道阻斷劑NPPB所阻斷，同時能被高滲溶液所抑制，具有容積敏感性。并且我們前文中報道容積敏感性氯通道在細胞的增殖、遷移、凋亡等過程中發揮重要的作用[4-8]，但其確切的分子本質并不清楚。本實驗還發現，乙醇濃度過高時，其激活氯電流的效應明顯下降甚至消失，其機制不清楚，我們以前的實驗發現，ATP對氯通道也有類似的雙相作用。

ClC-3是氯通道的一個亞型，被認為是容積敏感性氯通道最重要的候選蛋白之一，在細胞的電活動、容積調控、細胞增殖、分化、遷移、凋亡和胞內酸堿調節中都起著重要作用[8-10]。我們前期實驗證明ClC-3氯通道基因在CNE-2Z細胞上呈現高表達狀態[4]，為了進一步探討乙醇激活此種氯電流的分子本質，我們采用siRNA技術干擾ClC-3氯通道蛋白的表達，轉染序列由本課題前期實驗證明為有效序列[9],利用膜片鉗記錄相同濃度乙醇激活的氯電流，在CNE-2Z細胞激活的內外向氯電流都明顯減小,提示ClC-3氯通道可能是乙醇激活氯電流的主要分子基礎。將ClC-3干擾之后，17 mmol/L乙醇仍能夠記錄到一較微弱的氯電流，提示由于腫瘤細胞結構和功能的復雜性，可能還有其它的通道蛋白介導這種電流的產生，其具體機制還有待進一步探討。

本研究表明，一定劑量乙醇可以激活氯通道，誘發一個容積敏感的氯電流，而ClC-3氯通道蛋白是乙醇誘導氯電流的分子基礎。我們以前的實驗表明，氯通道參與細胞遷移和細胞周期的調控，并與鼻咽癌細胞的高增殖特性有關，提示乙醇可以通過激活氯通道促進鼻咽癌的發生發展。

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