復(fù)方血栓通系列品種中四種皂苷通用檢測方法研究※

李 華 喬 莉 周穎儀

復(fù)方血栓通系列品種中四種皂苷通用檢測方法研究※

李 華 喬 莉 周穎儀

目的 統(tǒng)一復(fù)方血栓通顆粒、片、滴丸和軟膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量測定方法。方法 采用高效液相色譜法，使用Thermo ODS2（5 μm，150.0 mm×4.6 mm）色譜柱，柱溫為20 ℃，以乙腈-水為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 ml/min，檢測波長為203 nm。結(jié)果 三七皂苷R1在0.0518～2.5900（r=0.9996）、人參皂苷Rg1在0.2090～8.3588（r=0.9991）、人參皂苷Re在0.0507～2.5371（r=0.9990）、人參皂苷Rb1在0.2044～8.1752（r=0.9995）范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率結(jié)果均能滿足分析要求。結(jié)論 該方法簡單可行，為復(fù)方血栓通品種中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1含量測定方法的統(tǒng)一提供了可靠的依據(jù)。

復(fù)方血栓通；三七皂苷R1；人參皂苷Rg1；人參皂苷Re；人參皂苷Rb1；通用檢測方法

復(fù)方血栓通顆粒、片、滴丸及軟膠囊四種劑型同為系列品種，其處方均由三七、黃芪、丹參和玄參組成，具有活血化瘀、益氣養(yǎng)陰的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明[1-4]，三七皂苷類化合物（三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1）是復(fù)方血栓通發(fā)揮活血化瘀藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。近年來，關(guān)于復(fù)方血栓通上述四種劑型中三七含量測定的文獻(xiàn)報道包括：郭建明等[5]采用薄層掃描法測定復(fù)方血栓通滴丸中三七的含量，以人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1為測定指標(biāo)；許俊音等[6]采用高效液相色譜法（HPLC）測定復(fù)方血栓通滴丸中人參皂苷Rg1的含量；何承隊等[7]采用高效液相色譜法（HPLC）測定復(fù)方血栓通片中人參皂苷Rg1的含量等，而對于顆粒劑和軟膠囊劑型的三七含量測定的方法尚未見文獻(xiàn)報道。本實驗建立了四種劑型中三七（以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1為指標(biāo)性成分）的高效液相含量測定法，統(tǒng)一復(fù)方血栓通系列品種的三七定量分析方法，可以此作為評價此系列品種質(zhì)量的重要指標(biāo)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Aglient1100高效液相色譜儀，KQ-300 DA超聲波清洗儀，Sartorius-CP225D萬分之一電子天平，Sartorius-CP224S十萬分之一電子天平。

1.2 試藥 乙腈為色譜純，甲醇為色譜純，水為超純水[由Milli-Q水處理系統(tǒng)購自Millipore公司（美國）]，甲酸、乙醇為分析純；三七皂苷R1（批號為110745-200617）、人參皂苷Rg1（批號為110703-200424；批號為110703-201027，含量以96.3%計）、人參皂苷Re（批號為110754-200822，含量以88.8%計；110754-201123，含量以89.1%計）、人參皂苷Rb1（批號為110704-201122，含量以92.9%計；110704-201223，含量以95.9%計），均購于中國藥品生物制品檢定院；復(fù)方血栓通顆粒、復(fù)方血栓通片、復(fù)方血栓通滴丸和復(fù)方血栓通軟膠囊均為市售。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Thermo ODS2（5 μm，150.0 mm×4.6 mm）；乙腈（B）-水（A）；梯度洗脫：0～12 min，19%～19% B；12～60 min，19%～36% B；流速：1.0 ml/min；柱溫：20 ℃；檢測波長：203 nm；進(jìn)樣量：10 μl；以外標(biāo)法測定。樣品色譜中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1色譜峰均與其他雜質(zhì)峰分離較好。理論板數(shù)按三七皂苷R1峰計算應(yīng)不低于4000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別取三七皂苷R1對照品、人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rb1對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1毫升含三七皂苷R1 50 μg、人參皂苷Rg1 200 μg、人參皂苷Re 50 μg、人參皂苷Rb1 200 μg的混合溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品，除去包衣，研細(xì)，精密稱取適量（復(fù)方血栓通顆粒取約1.00 g、復(fù)方血栓通片取約0.40 g、復(fù)方血栓通滴丸取約0.30 g、復(fù)方血栓通軟膠囊取約0.25 g），置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率45 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方比例取三七外的其他藥材，按各自藥品工藝項下的方法制成陰性樣品，再按“2.2.2”項的方法制備陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取混合對照品溶液（濃度為三七皂苷R1 51.8 μg/ml、人參皂苷Rg1 208.971 μg/ml、人參皂苷Re 50.74245 μg/ml及人參皂苷Rb1 204.38 μg/ml）1、2、5、10、15、20 μl；三七皂苷R1對照品溶液（濃度為518 μg/ml）5 μl；人參皂苷Rg1對照品溶液（濃度為835.884 μg/ml）10 μl；人參皂苷Re對照品溶液（濃度為507.4245 μg/ml）5 μl；人參皂苷Rb1對照品溶液（濃度為817.52 μg/ml）10 μl，注入液相色譜儀，按“2.1”項色譜條件測定，分別測定各自峰面積，以對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸處理，得三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，結(jié)果顯示各標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍內(nèi)線性良好（表1）。

表1 四種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 進(jìn)樣精密度試驗 吸取混合對照品溶液（濃度為三七皂苷R1 50.12 μg/ml、人參皂苷Rg1 196.6 μg/ml、人參皂苷Re 45.833 μg/ml及人參皂苷Rb1 195.636 μg/ml）按“2.1”項色譜條件測定，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計算三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb1峰面積的RSD（n=6）分別為1.7%、0.6%、2.1%、0.3%。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取復(fù)方血栓通顆粒（批號為100801）、復(fù)方血栓通片（批號為120321）、復(fù)方血栓通滴丸（批號為120601）、復(fù)方血栓通軟膠囊（批號為20120904），按“2.2.2”項供試品溶液制備制成供試品溶液，按“2.1”項色譜條件，分別在0、3、7、11、15、19、23、27 h進(jìn)樣，測定峰面積，結(jié)果供試品色譜中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb1峰面積的RSD（n=8），結(jié)果表明供試品溶液在27 h內(nèi)穩(wěn)定（表2）。

表2 四種成分的穩(wěn)定性試驗(%)

2.3.4 重復(fù)性試驗 取復(fù)方血栓通顆粒（批號為100801）、復(fù)方血栓通片（批號為120321）、復(fù)方血栓通滴丸（批號為120601）、復(fù)方血栓通軟膠囊（批號為20120904），按“2.2.2”項的方法各平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項的色譜條件進(jìn)樣測定、計算。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb1峰面積的平均含量（mg/g）及RSD（n=6），見表3。

2.4 回收率試驗

2.4.1 復(fù)方血栓通顆粒 精密稱取已知含量的復(fù)方血栓通顆粒0.5 g，共6份，精密加入混合對照品溶液（濃度為三七皂苷R1 0.0406 mg/ml、人參皂苷Rg1 0.14170545 mg/ml、人參皂苷Re 0.015222735mg/ml、人參皂苷Rb1 0.1204913mg/ml）25 ml，按“2.2.2”項的方法制備溶液，按“2.1”項的色譜條件進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1平均回收率分別為102.9%、97.4%、101.7%、98.3%，RSD（n=6）分別為1.1%、0.8%、1.2%、0.6%。

表3 四種成分的重復(fù)性試驗

2.4.2 復(fù)方血栓通片 精密稱取已知含量的復(fù)方血栓通片0.2 g，共6份，精密加入混合對照品溶液（濃度為三七皂苷R1 0.04155 mg/ml、人參皂苷Rg1 0.1346274 mg/ml、人參皂苷Re0.01522273 mg/ml、人參皂苷Rb10.0840745 mg/ml）25 ml，按“2.2.2”項的方法制備溶液，按“2.1”項的色譜條件進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1平均回收率分別為103.6%、100.1%、101.4%、102.4%，RSD（n=6）分別為0.6%、2.2%、2.0%、0.7%。

2.4.3 復(fù)方血栓通滴丸 精密稱取已知含量的復(fù)方血栓通滴丸0.15 g，共6份，精密加入混合對照品溶液（濃度為三七皂苷R1 0.01524 mg/ml、人參皂苷Rg1 0.1392127 mg/ml、人參皂苷Re 0.009499842 mg/ml、人參皂苷Rb1 0.0999278 mg/ml）25 ml，按“2.2.2”項的方法制備溶液，按“2.1”項的色譜條件進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1平均回收率分別為98.4%、103.8%、100.5%、96.7%，RSD（n=6）分別為0.6%、0.8%、2.6%、0.9%。

2.4.4 復(fù)方血栓通軟膠囊 精密稱取已知含量的復(fù)方血栓通軟膠囊0.125 g，共6份，并加入混合對照品溶液（濃度為三七皂苷R1 0.0343125 mg/ml、人參皂苷Rg1 0.1792346 mg/ml、人參皂苷Re 0.01583307 mg/ml、人參皂苷Rb1 0.08933085 mg/ml）25 ml，按“2.2.2”項的方法制備溶液，按“2.1”項的色譜條件進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1平均回收率分別為98.5%、104.1%、98.1%、96.8%，RSD（n=6）分別為2.0%、0.3%、1.5%、0.7%。

2.5 樣品測定 取復(fù)方血栓通顆粒（批號：100801、100901、130303、100902）、復(fù)方血栓通片（批號：120321、130318、130301、130302）、復(fù)方血栓通滴丸（批號：120601、120301、120401、120603）、復(fù)方血栓通軟膠囊（批號：20120904、20130105、 20121208、130201），分別按“2.2.2”項的方法制備供試品溶液，按“2.1”項的色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，按外標(biāo)一點法計算含量，見表4。

表4 復(fù)方血栓通樣品三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb1的含量(mg/g)

3 討論

3.1 提取溶劑的考察 經(jīng)考察不同溶劑如50%甲醇、80%甲醇、100%甲醇、50%乙醇、80%乙醇、100%乙醇超聲處理提取，結(jié)果：用50%乙醇和50%甲醇作為溶劑提取所得三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量較高，考慮到50%乙醇毒性較低，較為環(huán)保，且結(jié)合工藝制備過程中同樣采用50%乙醇作為提取溶劑，確定提取溶劑為50%乙醇。

3.2 提取方式的考察 經(jīng)考察不同超聲提?。?0、45、60 min）和加熱回流（15、30、45、60、120 min）時間，結(jié)果：不同提取方法及時間，測得三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量基本一致，從節(jié)約成本和簡化步驟角度考慮，確定提取方法及時間為超聲提取30 min。

為保證本系列品種的內(nèi)在質(zhì)量，本研究選擇了市場上常見的復(fù)方血栓通顆粒、復(fù)方血栓通片、復(fù)方血栓通滴丸及復(fù)方血栓通軟膠囊四種劑型，建立了高效液相色譜法的通用檢測方法測定三七皂苷類化合物（三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1）的含量。該方法準(zhǔn)確可行，為評價復(fù)方血栓通系列品種的質(zhì)量提供可靠的依據(jù)。

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Universal Method for the Determination of four saponins in Fufang XueShuanTong Preparations

Li Hua Qiao Li Zhou Yingyi

Objective To unified the method for the content determination of Notoginsenoside R1,Ginsenoside Rg1,Ginsenoside Re,Ginsenoside Rb1 of Fufang Xueshuantong granules,tablets,dripping pills and soft capsules. Methods By HPLC method;Notoginsenoside R1,Ginsenoside Rg1,Ginsenoside Re,Ginsenoside Rb1were analyzed on an Thermo ODS2(5 μm,150.0 mm×4.6 mm)column at 20 ℃;The gradient elution was acetonitrile-water at the flow rate of 1.0ml/min;The detection wavelength was 203 nm.Results Notoginsenoside R1,Ginsenoside Rg1,Ginsenoside Re,Ginsenoside Rb1 all have good linearity in the range of 0.0518～2.5900(r=0.9996),0.2090～8.3588(r=0.9991), 0.0507～2.5371(r=0.9990),0.2044～8.1752(r=0.9995)with satisfied precision,repetition,stability and recovery. Conclusion This method is simple,feasible,and can offer the reliable basis for unification of the standards.

Fufang XueShuanTong preparations;Notoginsenoside R1;Ginsenoside Rg1;Ginsenoside Re; Ginsenoside Rb1;Universal Method for the Determination

R286

A

1673-5846(2014)07-0014-04

廣東省食品藥品檢驗所，廣東廣州 510180

廣東省中醫(yī)藥局科研課題（20131139）

李華（1975-），本科、碩士研究生，中藥室主任，副主任中藥師，主要從事藥品質(zhì)量分析與管理。Tel：020-81886161，E-mail：1060870904@qq.com