湘蓮腐敗病菌的鑒定和抑菌藥劑篩選

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(湖南農業大學植物保護學院/植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，長沙 410128)

蓮藕是促進立體農業發展，整合農、林、牧、漁產業結構的一種重要水生作物品種[1]。湘蓮是湘潭市最富特色及最具增長潛能的產業，其年種植面積3 400～4 000 hm2，總產5 000 t左右。在湘蓮產業做大做強的過程中，湘蓮腐敗病的問題也日趨嚴重。控制該病不僅是廣大種植湘蓮農戶的迫切要求，同時也是湘蓮持續發展的需要[2]。為加強對湘蓮腐敗病的綜合防治，本研究對湘蓮腐敗病病原菌進行鑒定，以了解相關生物學性狀；并選擇生產中常用的農藥，包括百菌清、多菌靈、福美雙等，對湘蓮腐敗病病原菌生長抑制作用進行測定，以找到最適藥劑和相應的濃度，為湘蓮腐敗病的綜合治理策略的制定提供技術基礎。

1 湘蓮腐敗病病原菌鑒定

1.1 試驗材料

1.1.1 病藕樣品采集

選取湖南省湘潭縣花石鎮粒粒珍湘蓮生產基地中發病蓮的種藕。采取的病樣埋于土壤表層及以下5～15 cm。

1.1.2 試劑與藥品

甲醇為HPLC醇(Tedia公司)，二甲基亞砜(國藥集團)，酵母粉，蛋白胨粉，瓊脂粉，試驗所需無機鹽。

1.1.3 培養基

PDA培養基(g/L): 葡萄糖粉20，馬鈴薯200，瓊脂粉18，自然pH。

固體LB培養基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉5，氯化鈉10，瓊脂粉18，調節pH至7.0～7.3。

1.1.4 引物

采用16S rDNA通用引物，序列由上海生工合成并提供，5’端引物5’- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’; 3’端引物5’-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3’。從北京全式金生物技術有限公司購進Taq酶、dNTP及各類試劑盒。

1.1.5 主要儀器

PCR檢測儀器：ABI應用生物系統公司；顯微鏡帶熒光(80I)：尼康電器有限公司；強壓蒸汽除菌鍋：三洋電器有限責任公司；臺式冷凍離心機(Micro17R)：賽默飛世爾公司；超凈工作臺(SW-CJ-2G)：蘇州凈化設備有限公司；凝膠成像儀(H6ZO812M)：protein simple；恒溫振蕩器(IS-RDH1)：Crystal；電熱恒溫箱(DHP-9082A)：上海飛越試驗儀器有限公司；干燥箱(101A-2)：江南儀器儀表有限公司；電泳儀(TY0736)：伯樂生命科學產品有限公司；冰浴器(ICE01)：明日百傲科技有限公司；迷你微離心機(MiniStar)：托莫斯科學儀器有限公司； 冰箱(BCD-211we)：海爾股份有限公司；渦旋震蕩器：其林貝爾精密儀器儀表制造有限公司；電子天平: SHIMADZU。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離和純化

將感染湘蓮腐敗病的蓮藕樣品洗凈，切下5 cm長藕段先用無菌水漂洗一次，從罹病藕的病健交界處切取若干塊約1.0 cm×1.0 cm×0.4 cm的病組織。用0.1%升汞溶液消毒處理3.5 min，反復用清潔無菌水清洗4次，然后置于滅菌濾紙上。用手術刀切成小塊，將帶有湘蓮腐敗病病菌的小塊組織接種于PDA平板上(含氨芐青霉素50 mg/L，pH=7)，25℃培養7 d。用接種針挑取少量從病組織長出的真菌，用PDA繼代培養，再用平板劃線法進行菌落分離[4，5]。

1.2.2 形態學鑒定

根據病害癥狀、菌落形態大小、孢子、菌絲形狀長短等的特征來確定病原菌的種屬。病菌鑒定方法：根據單孢子菌落直徑、產生分生孢子的方法、分生孢子的形狀大小、是否有厚垣孢子等方面，從形態學上進行鑒別[6]。

1.2.3 主要病原真菌ITS序列分析

(1)PCR擴增。提取DNA，將培養基上的菌絲加50 μL無菌水用鑷子搗碎。經冰浴2 min后，隨之沸水浴1 min。如此重復3次后離心(12 000 r/min)。PCR反應體系總體積為200 μL。其中：EsayTaq Duffer 20 μL，正引物4 μL，反引物4 μL，模板4 μL，dNTPs 3 μL，taq酶3 μL，加ddH2O至200 μL。在離心管中用槍頭輕輕吸取混勻，分裝為4個50 μL的PCR管。采用ITS通用引物ITS1和ITS4(ITS1：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3；ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)進行PCR擴增獲得ITS序列。PCR反應條件：94℃預變性 5 min，94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延長60 s；40個循環；最后于72℃延伸10 min，保溫于4℃。檢驗：取PCR產物5 μL和Loading Bμffer 3 μL混勻于1.2%的瓊脂糖膠(含1 μL/mL的GelStain)上，用穩定電壓110 V電泳30 min。

(2)PCR產物的純化(使用EasyPure PCR Purification Kit試劑盒)。加40 mL100%乙醇到10 mL WB，取100 μL PCR產物，加入5倍容積的液體BB，充分攪勻后放入吸附柱中，靜置1 min，10.000*g離心60 s,棄去流出液。加進650 μL WB，10.000*g離心1 min，棄去流出液。10,000*g離心1 min，去除殘留的WB。在清潔的離心管中置入吸附柱，中心放入30 μL EB。洗脫DNA，于-20℃度保存。檢驗：取PCR產物5 μL和Loading Buffer 3 μL混合均勻在1.2%的瓊脂糖膠(含1μL/mL的GelStain)上，用穩定電壓100 V電泳55 min。用紫外線測定器觀察分析并照相。

(3)克隆(使用pEASY-T3 Cloning Kit試劑盒)反應體系的鑒定。將PCR產物0.4 μL加pEASY-T3 Cloning Vector 1 μL，常溫下混勻5 min，反應結束后在冰上放置。轉化：將連接產物與50 μL Trans1-T1的感受態細胞混合，在感受態細胞剛剛解凍時加入，輕彈混勻，冰浴20 min。42℃溫度下熱激30 s，馬上放于冰上2 min。加250 μL室溫的LB，200 rpm，37℃孵育1 h。取8 μL IPTG與40 μL 20 mg/mL X-gal混合，均勻涂在預備的平板上，37℃溫度下靜置30 min。設置一個對照組，不放X-gal。取200 μL菌液，4 000 rpm離心60 s，部分上清液棄去。懸浮菌液經微彈，全部菌液用于涂板，37℃培養過夜。

(4)陽性重組子的鑒定。挑選6個白色克隆并編號，分別用10 μL無菌水稀釋，渦旋混勻。取1 μL菌液做模板，在25 μL PCR反應體系下，以M13的正引物和反引物進行擴增，對重組子鑒定。PCR參照擴增反應條件。檢驗：取PCR產物5 μL和Loading Bμffer 3 μL混勻于1.2%的瓊脂糖膠(1 μL/mL的GelStain)，用穩定電壓100 V電泳55 min。用紫外線測定器觀察分析并照相。

(5)擴增。取4個50 mL燒瓶分別加20 mL的BL培養基(加40 μL 50 mg/mL的氨芐青霉素)，分別加入有陽性反應的菌落，200 rpm37℃過夜培養。擴大培養以后送往鉑尚生物技術有限公司長沙測序部 C1測序。測序結果經校對后，采用BLAST軟件，在序列雷同性方面進行對比搜索, 找出同源性稍高的相近序列，然后使用MEGA 4.0軟件以相鄰法(Neighbor-Joning) 建成系統發育樹，探究之間的親緣聯系。

1.2.4 致病性測定

采用柯赫氏法則開展。將分離純化的單菌落用于藕塊接種。

各供試菌種在PDA培養基上培養7 d，在無菌情況下，用7 mm無菌打孔器由外向內取餅，在藕塊中心接種，注意朝下應為菌絲面，接種完成后在28℃溫度條件下的培養箱中對藕塊進行保濕培養，5 d后拍照[7]。

1.3 結果與分析

1.3.1 病原菌分離

分離到的病原菌株XL菌絲白色，菌落圓形，呈輻射狀，初白色，后呈紫色或紫紅色，菌落邊緣無色,如圖1。

圖1 分離到的病原菌株XL

1.3.2 形態學觀察

在電子顯微鏡下觀察到菌絲發達，透明無色，有隔，有分枝，如圖2。

圖2 病原菌株XL的菌絲

在電子顯微鏡下觀察到孢子形狀不一，一般為橢圓形、圓柱狀或略呈彎曲狀，無色，單孢，如圖3。

圖3 病原菌株XL的孢子

1.3.3 ITS分析

(1) PCR擴增結果圖與藍白斑培養基圖。經引物ITS1和ITS4 PCR擴增完畢后，可獲得一600 bp上下的條帶，如圖4。

圖4 PCR純化產物擴增結果

以pEASY載體為載體克隆后篩選到陽性重組子，出現藍色和白色的菌落，如圖5。

圖5 克隆藍白斑培養基圖

(2)測序與分析。病原ITS序列測序結果如下：

AGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTT TACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCACTTGTT GCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGG ACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTAT ATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAA CTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGA AGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGC AGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACAT TGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCG AGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCTCGGGTTTGGTG TTGGGGATCGGCGAGCCCTTGCGGCAAGCCGGCCC CGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGCAGCCTCCATTG CGTAGTAGTAAAACCCTCGCAACTGGAACGCGGCG CGGCCAAGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAATGTTG ACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAG CATATCAATAAGCGGAGGA

將檢測的序列結果與GenBank中的16S rDNA序列通過Blast軟件，進行同源性比對。采用Clustalx2.0對在NCBI查找的具有同源性的基因序列進行多序列比對，采取鄰位相連法在軟件Mega4.0中建立系統發育進化樹，可知相似度最高的是尖鐮孢菌。病原菌株XL的系統發育樹如圖6。

圖6 病原菌株XL的系統發育樹

1.3.4 致病性回接試驗

接種5 d后藕塊表面呈褐色,剖面莖部可見近中心的維管束變淺褐色至黑褐色，如圖7。

圖7 霉菌菌株R1的菌絲

2 不同藥劑對湘蓮腐敗病病原菌的抑制作用

2.1 試驗材料

2.1.1 供試材料

本實驗室分離的湘蓮腐敗病病原菌。

2.1.2 供試藥劑

表1 6種農藥的有效成分、生產廠家和劑型

培養基和主要儀器同前。

2.2 試驗方法

2.2.1 強致病性菌株的篩選

采用病原菌菌絲塊接種藕塊的篩選方法，將接種的藕塊置于28℃培養箱中保濕培養，5 d后測定發病病斑的大小和發病藕塊的數量。選擇發病率最高、所致病斑最大的病原菌作為供試菌株[8]。

2.2.2 常用化學藥劑對腐敗病菌的室內毒力測定

采用生長速率法用藥劑對病原菌毒力的大小進行測定：將供試藥劑依據預試驗的結果，用無菌水調配成濃度適宜的且具有有效成分的母液，再將供試藥劑用巴氏消毒法滅菌(62℃水浴加熱30 min[5])，調配相對應的濃度，化學藥劑的最終濃度分別為400×、500×、600×、700×等，取2 mL藥劑和18 mL融化的PDA混勻，靜置冷卻成平板。將篩選出的強致病性菌株在PDA上培養5～6 d后，用直徑7.0 mm滅菌打孔器取菌餅。將菌絲片接種在具有相應濃度藥劑的PDA平板上，設空白滅菌培養基為對照。28℃恒溫培養箱培養后，用十字交叉法測量菌落直徑。以菌落直徑或半徑長短平均數值計算菌絲生長抑制比例。然后以藥劑濃度的對數為x，藥劑抑制率換算的幾率值為y，求得藥劑對蓮藕腐敗病菌的毒力回歸方程y=a+bx，并由方程計算各供試藥劑的抑制中濃度(EC50值)。根據各藥劑的抑制中濃度比較其對腐敗病菌毒力的大小。所用公式如下：

純生長量=菌落平均直徑-菌餅直徑

2.3 室內毒力測定

供試農藥對湘蓮腐敗病菌絲生長的抑制結果見表2。6種農藥對湘蓮腐敗病菌的毒力回歸方程、抑制中相關系數r以及濃度(EC50)見表3。比較各供試藥劑的EC50值發現，6種農藥對湘蓮腐敗病菌都有一定毒力，但毒力大小差異很大。其中50%硫磺·多菌靈的抑菌效果最好，EC50為19.87 μg/mL；其次為50%多菌靈WP，其EC50為104.11 μg/mL；此外，75%百菌清抑制效果較好，EC50值為108.85 μg/mL；25%腐霉·福美雙的效果較差，EC50為381.95 μg/mL；毒力最低的是50%福美雙WP，其EC50高達421.63 μg/mL。

表2 6種農藥對湘蓮腐敗病菌絲生長的抑制效果

(續表2)

表3 各處理藥劑的毒力回歸方程、相關系數和抑制中濃度

3 小結與討論

從湖南省湘潭縣花石鎮粒粒珍公司湘蓮生產基地中采集的帶病種藕上，通過分離、純化得到病原菌株。該菌落圓形，呈輻射狀，初白色，后呈紫色或紫紅色，菌落邊緣無色，菌絲白色。綜合形態學、16S rDNA序列測定及系統發育分析結果，最終將湘蓮腐敗病病原鑒定為尖鐮孢菌。

通過菌絲體生長速率法，測定了生產中防治尖鐮孢菌所引起病害的常用化學農藥對湘蓮腐敗病菌強致病株的室內毒力。試驗結果表明，不同農藥對湘蓮腐敗病菌都有一定毒力，但毒力大小差異很大。其中50%硫磺·多菌靈的抑菌效果最好，EC50為19.87 μg/mL，其次為多菌靈，福美雙的效果最差。這也許是由于各種農藥的作用機制不同所致。目前雖然還沒有湘蓮腐敗病菌對農藥產生抗藥性的報道，但為了延長高效農藥的使用年限，避免該病原菌因產生嚴重抗藥性而降低藥效，應根據所用藥劑的持效期，盡量減少用藥次數，并且交替使用作用機理不同的農藥。但不同農藥之間有無協同增效、交互抗藥性，還有待進一步研究。本試驗結果雖然證明了化學藥劑對蓮藕腐敗病具有一定的防效，田間施用化學農藥仍是控制蓮藕腐敗病的重要手段，所以有待繼續深入研究化學藥劑的田間防治，但在今后的研究中，應進一步對其它生物學特性進行研究并提出新的防治方法，尤其探索有效的生物防治方法是今后研究的重點。

[1] 羅海莉，李 潔，嚴守雷，等.蓮藕貯藏期主要致病真菌分離鑒定及其致病相關酶酶學特征研究[J].長江蔬菜，2011，10(16)：68-72.

[2] 曾凡榮，曾敬富，桂良杰，等.蓮藕腐敗病的診斷及綜合防控技術初報[J].現代園藝，2010(8)：111-112.

[3] 方中達.植病研究方法[M].北京：中國農業出版社，1979.634.

[4] 李志敏.蘋果腐爛病的發生與防治[J].河北農業科技，1994(9)：27-28.

[5] 蔡信之，黃君紅.微生物學(第二版)[M].北京：高等教育出版社，2002.142.

[6] 魏景超，真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1979.560.

[7] 梁志懷，魏 林，安哲宇.蓮藕腐敗病病原菌致病性及遺傳差異性的研究[J].長江蔬菜(學術版)，2010(14)：103-105.

[8] 梁志懷，魏 林，成燕清，等.不同殺菌劑對蓮藕腐敗病菌的室內毒力測定及田間防治效果[J].長江蔬菜(學術版)，2011 (16)：60-63.