6-羥基脫氧Canagliflozin的合成及其生物活性

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 300193；2.天津藥物研究院天津市新藥設(shè)計(jì)與發(fā)現(xiàn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；3.山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東濟(jì)南 250100)

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 300193；2.天津藥物研究院天津市新藥設(shè)計(jì)與發(fā)現(xiàn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；3.山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東濟(jì)南 250100)

以Canagliflozin(1)為起始原料，經(jīng)7步反應(yīng)合成了其6-OH脫氧產(chǎn)物4-(6-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2-［5-(4-氟苯基)噻吩-2-甲基］-1-甲基苯(8)，8是與母體1相似的新型SGLT2抑制劑，總收率21%，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR和MS表征。體外生物活性測(cè)試結(jié)果顯示，1和8對(duì)hSGLT2的IC50分別為3.9 nM和4.8 nM，對(duì)SGLT1的選擇性(SGLT2/SGLT1)分別為178和194。在大鼠尿糖排泄實(shí)驗(yàn)(UGE)中8具有很強(qiáng)的尿糖排泄作用，與母體1并無(wú)顯著性差異。

SGLT2抑制劑；Canagliflozin；脫氧；合成；抑制活性；尿糖排泄實(shí)驗(yàn)(UGE)

在糖尿病治療中，血液流經(jīng)腎小球時(shí)被過(guò)濾到原尿中的葡萄糖在腎近端小管中會(huì)被重新吸收到血液中，在這一重吸收過(guò)程中起主要作用的是Na+-依賴(lài)性葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)體2(SGLT2)，它對(duì)重吸收的貢獻(xiàn)約 90%，另外 10%的貢獻(xiàn)來(lái)源于SGLT1［1-2］。因此抑制SGLT2就能增加尿糖排出，從而達(dá)到降低血糖的目的。SGLT2已成為近年來(lái)糖尿病治療領(lǐng)域最有前景的新靶點(diǎn)，其中研究進(jìn)展較快的SGLT2抑制劑Dapagliflozin(Chart 1)［3］和Canagliflozin(1)［4］已分別于2012年在歐盟和2013年在美國(guó)上市。

Scheme 1

Chart 1

在前期研究［5］中我們發(fā)現(xiàn)Dapagliflozin的6-OH脫氧產(chǎn)物具有比母體更強(qiáng)的抑制SGLT2的能力。為了研究該類(lèi)6-OH脫氧引起活性增強(qiáng)的普遍性，本文合成了1的6-OH脫氧產(chǎn)物——4-(6-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2-［5-(4-氟苯基)噻吩-2-甲基］-1-甲基苯(8)。即1在咪唑作用下與叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)反應(yīng)，選擇性保護(hù)葡萄糖環(huán)上的6-OH［6］得4-(6-O-叔丁基二甲基硅基-β-D-吡喃葡萄糖基)-2-［5-(4-氟苯基)噻吩-2-甲基］-1-甲基苯(2)；2在 4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化下經(jīng)Ac2O乙酰化，保護(hù)其葡萄糖環(huán)上的其余三個(gè)OH得4-(2，3，4-三-O-乙酰基-6-O-叔丁基二甲基硅基-β-D-吡喃葡萄糖基)-2-［5-(4-氟苯基)噻吩-2-甲基］-1-甲基苯(3)；3在80%醋酸水溶液中于40℃脫去TBDMS保護(hù)基得4-(2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-2-［5-(4-氟苯基)噻吩-2-甲基］-1-甲基苯(4)；在Et3N作用下，4與甲磺酰氯(MsCl)反應(yīng)，將其暴露的6-OH轉(zhuǎn)化為甲磺酸酯得4-(2，3，4-三-O-乙酰基-6-O-甲磺酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-2-［5-(4-氟苯基)噻吩-2-甲基］-1-甲基苯(5)；5與KI于80℃反應(yīng)，將甲磺酸酯轉(zhuǎn)化為碘化物4-(2，3，4-三-O-乙酰基-6-脫氧-6-碘-β-D-吡喃葡萄糖基)-2-［5-(4-氟苯基)噻吩-2-甲基］-1-甲基苯(6)；用三正丁基氫化錫(n-Bu3SnH)和偶氮二異丁腈(AIBN)于室溫還原6脫碘得4-(2，3，4-三-O-乙酰基-6-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-2-［5-(4-氟苯基)噻吩-2-甲基］-1-甲基苯(7)；7在MeOH中用30%NaOH溶液水解脫去乙酰基得目標(biāo)產(chǎn)物8(Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR，ESI-MS和MS表征。并對(duì)1和8的生物活性進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

X-4型顯微熔點(diǎn)儀(溫度未校正)；Bruker AV 400型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Agilent Q-TOF 6510型質(zhì)譜儀(電噴霧離子源，直接進(jìn)樣)。

1按文獻(xiàn)［4］方法合成；其余所用試劑均為分析純，其中DMF使用前經(jīng)干燥處理。

1.2 合成

(1)2的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入DMF 50 mL，1 8.54 g (19.21 mmol)和咪唑3.93 g(57.68 mmol)，攪拌使其溶解；冰水浴冷卻，緩慢滴加TBDMSCl(4.64 g)的DMF(10 mL)和CH2Cl2(1 mL)溶液，滴畢，于室溫反應(yīng)過(guò)夜(TLC監(jiān)測(cè))。小心倒入300 mL冰水中，用CH2Cl2(3×100 mL)萃取，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水(2×100 mL)洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，旋蒸脫溶后經(jīng)硅膠柱層析［洗脫劑:A=V (乙酸乙酯)∶V(石油醚)=3∶1］純化得白色泡沫狀固體 2 10.44 g，收率 98%；1H NMR δ: 7.54～7.58(m，2H)，7.25(d，J=3.6 Hz，1H)，7.16～7.20(m，3H)，7.10(s，2H)，6.76(d，J= 3.6 Hz，1H)，4.89～4.90(m，2H)，4.70(d，J= 6.0 Hz，1H)，4.10(s，2H)，3.96(d，J=9.6 Hz，1H)，3.85(d，J=10.8 Hz，1H)，3.18～3.26(m，3H)，3.10～3.12(m，1H)，2.25(s，3H)，0.79 (s，9H)，-0.04(s，3H)，-0.08(s，3H)。

(2)3的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入吡啶50 mL和2 10.00 g(17.90 mmol)，攪拌使其溶解；冰水浴冷卻，緩慢滴加Ac2O 30 mL，滴畢，加入DMAP 1.00 g，于室溫反應(yīng)過(guò)夜(TLC監(jiān)測(cè))。小心倒入300 mL冰水中，用CH2Cl2(3×100 mL)萃取，合并有機(jī)相，依次用3%鹽酸(2×100 mL)和飽和食鹽水(2× 100 mL)洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，旋蒸脫溶后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:A=1∶5)純化得白色固體3 11.60 g，收率94%，m.p.94℃～96℃；1H NMR δ:7.54～7.58(m，2H)，7.26(d，1H，J=3.6 Hz)，7.11～7.21(m，5H)，6.74(d，J=3.6 Hz，1H)，5.30(t，J=9.4 Hz，1H)，5.08(t，J=9.6 Hz，1H)，4.87(t，J=9.8 Hz，1H)，4.58(d，J= 9.6 Hz，1H)，4.06～4.15(m，2H)，3.82(dd，J= 2.4 Hz，10.0 Hz，1H)，3.69～3.71(m，1H)，3.63(dd，J=4.4 Hz，11.6 Hz，1H)，2.25(s，3H)，1.99(s，3H)，1.90(s，3H)，1.71(s，3H)，0.81(s，9H)，-0.02(s，3H)，-0.08(s，3H)。

(3)4的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入冰醋酸80 mL和3 11.50 g(16.79 mmol)，攪拌使其溶解；緩慢滴加水20 mL，于40℃反應(yīng)約5 h(TLC監(jiān)測(cè))。倒入300 mL冰水中，用CH2Cl2(3×100 mL)萃取，合并有機(jī)相，依次用飽和 NaHCO3溶液(2×100 mL)和飽和食鹽水(2×100 mL)洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，旋蒸脫溶后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑: A=1∶3)純化得白色固體4 7.54 g，收率79%，m.p.150℃ ～152℃；1H NMR δ:7.55～7.59 (m，2H)，7.26(d，J=3.6 Hz，1H)，7.14～ 7.21(m，5H)，6.74(d，J=3.6 Hz，1H)，5.29 (t，J=9.6 Hz，1H)，5.02(t，J=9.8 Hz，1H)，4.94(t，J=9.6 Hz，1H)，4.74(t，J=4.8 Hz，1H)，4.57(d，J=9.6 Hz，1H)，4.12(s，3H)，3.75～3.79(m，1H)，3.49～3.52(m，1H)，3.40～3.44(m，1H)，2.25(s，3H)，1.99(s，3H)，1.90(s，3H)，1.70(s，3H)。

(4)5的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入干燥CH2Cl250 mL，4 7.50 g(13.14 mmol)和 Et3N 4.01 g(39.67 mmol)，攪拌使其溶解；冰水浴冷卻，緩慢滴加MsCl(2.27 g)的CH2Cl2(10 mL)溶液，滴畢，于室溫反應(yīng)1 h(TLC監(jiān)測(cè))。小心傾入300 mL冰水中，用CH2Cl2(3×100 mL)萃取，合并有機(jī)相，依次用1%鹽酸(2×100 mL)和飽和食鹽水(2×100 mL)洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，旋蒸脫溶后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:A=1∶4)純化得白色固體5 5.23 g，收率61%，m.p.157℃ ～159℃；1H NMR δ: 7.55～7.59(m，2H)，7.27(d，J=3.6 Hz，1H)，7.15～7.21(m，5H)，6.74(d，J=3.2 Hz，1H)，5.36(t，J=9.4 Hz，1H)，5.08(t，J=9.8 Hz，1H)，5.01(t，J=9.6 Hz，1H)，4.67(d，J=9.6 Hz，1H)，4.25～4.33(m，2H)，4.14～4.18(m，1H)，4.12(s，2H)，3.11(s，3H)，2.25(s，3H)，2.02(s，3H)，1.92(s，3H)，1.71(s，3H)。

(5)6的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入DMF 25 mL，5 5.13 g (7.91 mmol)和KI 6.70 g(40.35 mmol)，攪拌使其溶解；于80℃反應(yīng)12 h(TLC監(jiān)測(cè))。稍冷后小心傾入300 mL冰水中，用CH2Cl2(3×100 mL)萃取，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水(2×100 mL)洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，旋蒸脫溶后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:A=1∶5)純化得白色固體6 4.28 g，收率79.5%，m.p.154℃ ～156℃；1H NMR δ: 7.55～7.59(m，2H)，7.28(d，J=3.6 Hz，1H)，7.16～7.21(m，5H)，6.76(d，J=3.6 Hz，1H)，5.35(t，J=9.4 Hz，1H)，4.92(t，J=9.2 Hz，1H)，4.90(t，J=9.6 Hz，1H)，4.69(d，J= 10.0 Hz，1H)，4.12(s，2H)，3.69～3.73(m，H)，3.49(dd，J=2.8 Hz，11.2 Hz，1H)，3.24～3.26(m，1H)，2.26(s，3H)，2.02(s，3H)，1.90(s，3H)，1.71(s，3H)。

(6)7的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入干燥甲苯30 mL，6 4.20 g(6.17 mmol)，AIBN 1.04 g(6.31 mmol)和n-Bu3SnH 5.51 g(18.94 mmol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下于室溫反應(yīng)過(guò)夜(TLC監(jiān)測(cè))。小心傾入200 mL水中，用CH2Cl2(3×100 mL)萃取，合并有機(jī)相，依次用飽和食鹽水(2×100 mL)洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，旋蒸脫溶后經(jīng)硅膠柱層析 (洗脫劑:A= 1∶6)純化得白色固體7 2.38 g，收率69.5%，m.p.149℃ ～151℃；1H NMR δ:7.55～7.59 (m，2H)，7.27(d，J=3.6 Hz，1H)，7.15～7.21(m，5H)，6.74(d，J=3.6 Hz，1H)，5.26 (t，J=9.6 Hz，1H)，4.97(t，J=9.6 Hz，1H)，4.81(t，J=9.6 Hz，1H)，4.55(d，J=9.6 Hz，1H)，4.12(s，2H)，3.82～3.86(m，1H)，2.24 (s，3H)，2.02(s，3H)，1.91(s，3H)，1.70(s，3H)，1.12(d，J=6.4 Hz，3H)。

(7)8的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入MeOH 50 mL和7 2.30 g(4.15 mmol)，攪拌使其呈懸浮液；加入30% NaOH溶液10 mL，回流反應(yīng)0.5 h(TLC監(jiān)測(cè))。稍冷后傾入300 mL冰水中，用濃鹽酸調(diào)至pH 7～8，用乙酸乙酯(3×50 mL)萃取，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水(2×100 mL)洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，旋蒸脫溶后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:乙酸乙酯)純化得白色固體8 1.53 g，收率86%，m.p. 139℃ ～141℃；1H NMR δ:7.56～7.60(m，2H)，7.26(d，J=3.6 Hz，1H)，7.17～7.21(m，3H)，7.10～7.12(m，2H)，6.78(d，J=3.6 Hz，1H)，4.92(d，J=5.2 Hz，1H)，4.86(d，J=4.0 Hz，1H)，4.68(d，J=5.2 Hz，1H)，4.14(d，J= 16.0 Hz，1H)，4.09(d，J=16.0 Hz，1H)，3.96 (d，J=9.2 Hz，1H)，3.14～3.31(m，3H)，2.90～2.95(m，1H)，2.25(s，3H)，1.15(d，J= 6.0 Hz，3H)；13C NMR δ:162.54，160.12，143.57，140.19，138.23，137.37，134.85，130.47，129.64，128.85，126.94，126.86，126.31，126.05，123.34，115.93，115.72，81.32，78.16，75.71，75.59，74.81，33.35，18.75，18.23；ESI-MS m/z: 446.05{［M+NH4］+}。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

(1)4的合成

4的合成由3在80%醋酸溶液中于40℃脫去TBDMS保護(hù)基而得。研究表明過(guò)高的反應(yīng)溫度會(huì)極大地增加反應(yīng)速度，但是很大部分4會(huì)發(fā)生乙酰基從4-O-位轉(zhuǎn)位到6-O-位。

(2)8的合成

在8的合成中，7在MeOH中經(jīng)30%NaOH溶液水解脫去乙酰基。值得注意的是，由于水解后反應(yīng)混合物中產(chǎn)生了醋酸鹽，因此在用乙酸乙酯萃取前pH不可調(diào)得過(guò)低(＜3)，否則水解產(chǎn)生的醋酸鹽會(huì)在酸性條件下被萃取到有機(jī)相中而在終產(chǎn)物8中殘留超標(biāo)。

2.2 1和8的生物活性

按文獻(xiàn)［5］方法測(cè)定1和8體外對(duì)hSGLT2和hSGLT1抑制的IC50值，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，1和8的IC50(hSGLT2)分別為3.9 nM和4.8 nM；IC50(hSGLT1)分別為695 nM和929 nM，對(duì)SGLT1的選擇性(SGLT2/SGLT1)分別為178和194。可見(jiàn)1經(jīng)6-OH脫氧成8后，對(duì)hSGLT2的抑制活性略有減弱，但變化不大。但是脫氧后對(duì)hSGLT1的抑制減弱了很多，因此導(dǎo)致脫氧產(chǎn)物8對(duì)hSGLT2的選擇性有一定增加。綜合對(duì)hSGLT2的抑制活性和hSGLT2/hSGLT1選擇性的評(píng)價(jià)可以看出，8相對(duì)于母體化合物1具有相近的成藥性，說(shuō)明1中6-OH對(duì)維持其活性不是必要的，即6-OH不是關(guān)鍵藥效團(tuán)，這個(gè)結(jié)論與前述［5］6-OH不是Dapagliflozin的關(guān)鍵藥效團(tuán)的結(jié)論一致。

表1 1和8體外對(duì)hSGLT2和hSGLT1的抑制活性Table 1 In vitro inhibition activities of 1 and 8 against hSGLT1 and hSGLT2

按文獻(xiàn)［5］方法測(cè)定了8對(duì)大鼠的尿糖UGE值，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，在大鼠尿糖試驗(yàn)中，8在用藥量分別為2 mg·kg-1，6 mg·kg-1，18 mg·kg-1和54 mg·kg-1時(shí)，均能誘導(dǎo)出比母體化合物1更多的尿糖，但除6 mg·kg-1外(p＜0.05)，其余各劑量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性差異(p＞0.05)。

表2 1和8的大鼠尿糖測(cè)定結(jié)果Table 2 The rat UGE results of 1 and 8

3 結(jié)論

生物活性測(cè)試結(jié)果顯示，1的6-OH脫氧產(chǎn)物8比母體化合物1的體外活性稍弱，但體內(nèi)活性稍強(qiáng)(這種體內(nèi)外活性的微小差異可能與兩者的藥代性質(zhì)的差異有關(guān)，8的藥代性質(zhì)應(yīng)該略好于1)，總體上認(rèn)為兩者的活性并無(wú)顯著差異，說(shuō)明1中葡萄糖片段中的6-OH不是關(guān)鍵藥效團(tuán)，這對(duì)于設(shè)計(jì)新的SGLT2抑制劑具有重要的指導(dǎo)意義。

［1］Washburn W N.Development of the renal glucose reabsorption inhibitors:A new mechanism for the pharmacotherapy of diabetes mellitus type 2［J］.J Med Chem，2009，52:1785-1794.

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6-羥基脫氧Canagliflozin的合成及其生物活性*

韓書(shū)文1，2，徐華強(qiáng)2，3，王玉麗2，張玲鈺2，3，史永恒2，劉冰妮2，魏群超2，徐為人1，2，趙桂龍2

Synthesis and Biological Activities of 6-Deoxylated Canagliflozin

HAN Shu-wen1，2， XU Hua-qiang2，3， WANG Yu-li2， ZHANG Ling-yu2，3，SHI Yong-heng2， LIU Bing-ni2， WEI Qun-chao2， XU Wei-ren1，2， ZHAO Gui-long2
(1.Graduate School，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Tianjin Key Laboratory of Molecular Design and Drug Discovery，Tianjin Institute of Pharmaceutical Research，Tianjin 300193，China；3.School of Chemistry and Chemical Engineering，Shandong University，Jinan 250100，China)

6-Deoxylated Canagliflozin，4-(6-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-2-［5-(4-fluorophenyl)thiophen-2-yl］-1-toluene(8)，a novel SGLT2 inhibitor，was synthesized by a seven-step reaction from Canagliflozin(1)in overall yield of 21%.The structure was characterized by1H NMR，13C NMR and MS.In vitro assays showed that the properties of 1 and 8 were as follows:IC50(hSGLT2)were 3.9 nM and 4.8 nM，selectivity(SGLT2/SGLT1)were 178 and 194，respectively.In vivo primary biological assays exhibited that 8 could induce a considerable amount of urinary glucose in rat urinary glucose excretion test，however it was not statistically different from 1.

SGLT2 inhibitor；Canagliflozin；deoxy；synthesis；inhibition activity；urinary glucose excretion text(UGE)

O629.11；O626.1；O625.1

A

1005-1511(2014)01-0001-05

2013-05-02；

2013-12-13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21302141)；天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(10ZCKFSH01300)

韓書(shū)文(1986-)，男，漢族，黑龍江齊齊哈爾人，碩士研究生，主要從事藥物化學(xué)的研究。

趙桂龍，副研究員，Tel.022-23006869，E-mail:zhao_guilong@126.com