不同分子生物學方法檢測手足口病標本的應用分析

關桂英 王風朝

不同分子生物學方法檢測手足口病標本的應用分析

關桂英 王風朝

目的 比較不同分子生物學方法檢測手足口病標本的敏感性及應用價值。方法 選取山東莘縣疾病預防控制中心2012年1月～2013年8月收集的100例手足口病標本為研究對象，根據分子生物學檢測方法不同，將其分為巢式PCR組、一步法RT-PCR（逆轉錄-聚合酶鏈反應）組及實時RT-PCR組，對3組腸道病毒71型檢測陽性率結果進行對比分析。結果 巢式PCR對住院標本、輕癥標本及重死標本檢測的EV71陽性率分別為84.62%、25%及83.33%，實時RT-PCR檢測的80.77%、23.31%及77.78%，均明顯高于一步法RT-PCR檢測的15.38%、8.92%、44.44%，比較有統計學意義（P＜0.05)。結論 手足口病原體主要是EV71及CA16，且巢式PCR和實時RT-PCR生物檢測敏感性相對一步法RT-PCR要高。

手足口病；巢式PCR；一步法；逆轉錄-聚合酶鏈反應

手足口病作為臨床上一種常見傳染疾病，多發病于兒童，特別是不足三歲的嬰幼兒，易引發肺水腫、腦炎等并發癥，嚴重者甚至死亡[1]。相關研究表明，腸道病毒71型（EV71）是引發手足口病的主要病原體，此外該病毒還易引起腦炎、無菌性腦膜炎等，危害性大[2]。本研究就此對本市人民醫院100例手足口病標本采取3種不同分子生物學檢測腸道病毒71型，比較不同分子生物學檢測手足口病的敏感性及特點，為感染EV71的患兒及時治療提供重要依據，報道具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取山東莘縣疾病預防控制中心2012年1月～2013年8月收集的100例手足口病標本為研究對象，其中住院患者標本26例，輕癥患者標本56例，重死患者標本18例。所有標本患者均符合《手足口病診療指南》[3]中對手足口病制定的診斷標準：（1）發熱；（2）皮疹，且足底等部位出現水泡等癥狀；（3）口腔潰瘍；（4）中樞神經系統相關癥狀。

1.2 檢測方法

1.2.1 標本采集 實行無菌操作，手足口病患者發病后3～7d內采集1～2g糞便，保存在消毒滅菌后的專用盒內。利用干棉簽對患者鼻咽部位進行正確的擦拭，采集完畢后馬上放入專用試管中。上述標本均保存在-80℃冰箱中。

1.2.2 標本檢測 嚴格按照病毒核酸提取試劑使用說明書操作，提取病毒。根據GenBank中常見EV端相關基因序列選擇合理的引物，并利用相關軟件輔助對腸道病毒VP1-VP3間進行EV71及CA16（腸道病毒柯薩奇）引物序列排列，不同引物產生不同的產物。對手足口病標本分別進行巢式PCR、一步法RT-PCR（逆轉錄-聚合酶鏈反應）及實時RT-PCR檢測。RT-PCR反應條件：45攝氏度逆轉錄45min，94℃預變性2min/變性20s，45℃退火25s，然后72℃延伸30s，計36個循環。巢式PCR反應條件如上。實行病毒陽性率和陰性率對比試驗，共試驗3次。

巢式PCR及一步法RT-PCR采用瓊脂糖凝膠電泳（1.5%）分析結果，實時RT-PCR利用熒光自動檢測儀分析結果。

1.3 統計學方法 應用SPSS18.0統計學軟件分析所得數據，正態計量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

3組方法手足口病標本檢測結果具體見表1。住院及重死標本中主要感染病毒為EV71，輕癥標本主要感染病毒為CA16。且巢式PCR組EV71陽性率為：住院患者標本84.6%，輕癥患者標本25%，重死患者標本83.33%；一步法RT-PCR組EV71陽性率為：住院患者標本15.38%，輕癥患者標本8.92%，重死患者標本44.44%；實時RT-PCR組EV71陽性率為：住院患者標本80.77%，輕癥患者標本23.21%，重死患者標本77.78%。巢式PCR及實時RT-PCR檢測敏感性明顯高于一步法RT-PCT方法，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 3種不同分子生物學方法檢測手足口病陽性結果比較［n(%)］

3 討論

最早在1957年就有人詳細介紹過手足口病，次年相關研究人員從手足口病患者中分離出CA16[4]，隨后1974年美國學者從腦炎患者標本中分離出EV71，自此臨床上認為手足口病的主要病原體為CA16和EV71[5]。目前臨床上檢測手足口病的分子生物方法主要有巢式PCR、一步法RT-PCR及實時RT-PCR等，且不同分子生物學方法對手足口病標本檢測的敏感性、特異性等是不同的[6]。

本研究對100例手足口病標本采取上述3種不同分子生物學方法檢測。結果顯示，巢式PCR對住院標本、輕癥標本及重死標本檢測的EV71陽性率分別為84.62%、25%及83.33%，實時RT-PCR檢測的80.77%、23.31%及77.78%，均明顯高于一步法RT-PCR檢測的15.38%、8.92%、44.44%。一步法RT-PCR指的是將其中一條RNA鏈進行逆轉錄成為互補DNA，之后再以新形成的DNA鏈通過PCR進行復制[7]，以達到擴增的目的。實時RT-PCR則是在一定時間內通過DNA的增幅來進行定量分析。而巢式PCR共分為兩步，第一步是將目標DNA模板藍色的第一對引物結合起來，得到目的片段，第二步是使用第二套引物對第一步中經過PCR擴增的產物再次進行第二輪擴增。由于第一套引物在PCR產物的內部，而非目的片斷一般不會同時包含兩套引物，第二步的擴增過程中不會有非目的片段被擴增[8]。所以改種方法不會出現非特異性擴增所引發的污染問題，特異性較高，是目前擴增質量最高并且監測效果最好的一種方法。所得結果也與相關文獻的結論一致。

由此可知，巢式PCR檢測以及實時RT-PCR檢測方法的敏感性明顯高于一步法RT-PCR，均可作為手足口病標本檢測的重要手段。

[1] 周俊新.手足口病發病影響因素調查研究[J].當代醫學,2013,19(10): 163-164.

[2] 宮相翠,徐元芹,蔣艷，等.EV71相關手足口病合并肺水腫的體液免疫作用[J].當代醫學,2012,18(28):92-93.

[3] 閻巖,王定明,胡靜，等.3種分子生物學方法診斷手足口病的比較[J].貴州醫藥,2011,35(2):107-109.

[4] 侯佩強,張榮強,倪楠.2010年泰安市手足口病病原學檢測分析[J].中華實驗和臨床感染病雜志(電子版),2012,3(5):209-211.

[5] 任倩.手足口病重要病毒序列分析及生物信息學表征[D].泰安:泰山醫學院,2012：36-37.

[6] 張榮強,侯佩強,倪楠，等.泰安市2010～2012年手足口病不同標本檢測結果分析[J].泰山醫學院學報,2013,4(10):248-251.

[7] 周建芳,陳嘉臻,繆忻余，等.2010～2012年浙江省奉化市231例手足口病病原監測結果及病毒聚類分析[J].中國病毒病雜志,2013, 4(4):284-289.

[8] 吳世嘉.基于上轉換熒光納米探針的高靈敏微生物毒素檢測方法研究[D].無錫:江南大學,2013：25-26.

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.22.102

山東 252400 山東莘縣疾病預防控制中心檢驗科 （關桂英王風朝）