LC-MS/MS測定人參蜂王漿口服液中15種藥物殘留

鄧鳴，朱斌

（廣西食品藥品檢驗所，廣西南寧530021）

人參蜂王漿口服液是以人參、蜂王漿、五味子、蜂蜜等為主要原料制成的保健食品，經功能試驗證明具有免疫調節、延緩衰老的保健功能[1]。其中蜂王漿和蜂蜜是具有保健作用的蜂產品，它們富含維生素、蛋白質、有機酸、酶類、礦物質等多種營養成份，具有調節生理機能、消炎殺菌、滋補強壯、抗腫瘤、防衰老、增強免疫力等功效，蜂產品作為原輔料廣泛用于食品、保健食品及藥品中，它的質量也影響到了成品的質量安全。在蜜蜂養殖過程中，蜂農往往在飼料中添加藥物用以防治蜂群染病，如四環素類藥物用于防治蜜蜂的白惡病、腐臭病；大環內酯類藥物用于防治蜜蜂幼蟲病等。然而過量或不正確使用藥物會導致蜂產品中藥物殘留，長期食用含有藥物的食品對人體功能有一定的損害，影響到人類的健康。目前，已有多種方法被報道用以檢測蜂產品中藥物殘留，方法主要有：微生物法[2]、分光光度法[3]、液相色譜法[4-5]和液質聯用方法[6-8]等。檢測的藥物種類也從以前較單一發展成現在可同時進行幾類或幾十種藥物殘留檢測的方法，其中液質聯用方法因其具有良好的適用性、可同時定性定量功能及高靈敏度的特點，成為可同時檢測多種藥物殘留的主要檢測方法。本實驗建立了高效液相色譜-串聯質譜檢測方法同時測定喹諾酮類、四環素類、大環內酯類、林可胺類等15種藥物殘留，為更好的評價和控制人參蜂王漿的質量提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與樣品

1.1.1 儀器

Agilent 6460型串聯三重四極桿質譜，配Agilent 1290型液相色譜儀：Agilent公司，美國:；Milli-Q去離子水發生器：Milli-Q公司，美國；高速冷凍離心機：ttettich公司，德國；樣品自動濃縮儀：Genevac公司，英國。

1.1.2 試劑與材料

林可霉素、土霉素、四環素、金霉素、多西環素、紅霉素、氧氟沙星、阿奇霉素、克林霉素、環丙沙星、諾氟沙星、羅紅霉素，購于中國食品藥品檢定研究院。達氟沙星、恩諾沙星、二氟沙星購于中國獸醫藥品監察所。甲醇、乙腈為色譜純試劑，水為超純水，其它試劑為分析純。Oasis HLB柱（500 mg/6 mL，waters公司）。

溶液的制備：對照品分別用甲醇配制成1.0 mg/mL儲備液，置于4℃保存，臨用時根據需要稀釋成適當濃度的混合標液。

1.1.3 樣品

4批人參蜂王漿口服液樣品購自本地藥店。

1.2 分析條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent EclipseXDB-C18（5μm，150×4.6mm）；流動相：A：甲醇-乙腈（3 ∶2），B：0.1%甲酸，梯度洗脫程序：0～8 min（A：10%）；8 min～15 min（A：10%～30%）；15 min～16 min（A：30%～10%），流速為 0.5 mL/min。進樣量 10 μL；柱溫 25℃。

1.2.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；檢測方式：多反應監測（MRM）；掃描方式：正離子掃描；干燥氣：氮氣；干燥氣溫度：325℃；干燥氣流速：10 L/min；霧化氣壓力：0.006Pa；鞘流氣溫度：400℃；鞘流氣流速：10 L/min。母離子、子離子、駐留時間、碎裂電壓、碰撞能量見表1。

1.3 樣品溶液的制備

稱取供試樣品約5 mL，置于50 mL離心管中，加入0.1 mol/L EDTA溶液0.1 mL，再加入pH 8.0磷酸鹽緩沖液20 mL，混勻，渦旋2 min，以4 000 r/min的速率離心5 min，上清液置于另一離心管中，殘渣再加入pH 8.0磷酸鹽緩沖液10 mL，渦旋2 min，以4 000 r/min的速率離心5 min，合并上清液，上清液以1 mL/min的速度通過活化后的固相萃取柱（固相萃取小柱依次用5mL甲醇，5 mL水活化），先用5 mL水淋洗兩次，再用5 mL甲醇洗脫（控制流速1 mL/min～2 mL/min。將洗脫液用自動濃縮儀于45℃濃縮至干，用1.00 mL流動相溶解殘渣，0.22 μm微孔濾膜濾過，進LC-MS/MS分析。

表1 15種藥物質譜參數Table 1 Parameter of mass spectra of 15 Drugs

2 結果與討論

2.1 樣品提取凈化條件考察

蜂蜜中含有大量的糖份和其它有機物質，因此需要通過采用適當的提取和凈化方式來對樣品進行處理，以便盡可能的減少干擾，提高分析靈敏度。本文考察了分別用pH 8.0磷酸鹽緩沖液、pH 8.0磷酸鹽緩沖液-甲醇（95∶5）、5%甲醇溶液、5%乙腈溶液對加標樣品進行提取，結果采用pH 8.0磷酸鹽緩沖液提取加標樣品時，各待測組份的回收率均較高。由于四環素類物質易與金屬離子螯合，降低提取回收率，因此加入0.1 mol/L EDTA溶液0.1 mL，結果表明加入0.1 mol/L EDTA溶液可顯著提高四環素類被測物的回收率，且對其它組份沒有影響。

本文考察了使用不同類型固相萃取小柱（HLB、C18）凈化，不同的洗脫溶劑（甲醇、乙腈、乙酸乙酯）處理提取液的效果，結果表明采用Oasis HLB固相萃取小柱凈化，甲醇洗脫時大部分被測組份的回收率為最高。

2.2 液相色譜條件優化

流動相對待測組份的峰形、分離度有很大影響，分別考察了水相為含有0.1%甲酸的10 mmol/L乙酸銨溶液、0.1%甲酸溶液、10 mmol/L乙酸銨溶液及有機相為甲醇、乙腈、甲醇和乙腈（3∶2）做為流動相時的分離效果，試驗結果表明，以甲醇-乙腈（3∶2）-0.1%甲酸為流動相做梯度洗脫時，各組份的分離度與峰形均較好。圖1為標準品混合溶液的提取離子流圖。

圖1 15種藥物混合溶液選擇離子流圖Fig.1 MRM chromatograms of 15 drugs

2.3 質譜條件優化

分別在正離子模式下對各待測化合物進行母離子全掃描，再對其子離子進行全掃描，以各子離子的提取離子色譜峰峰高為指標，對各子離子的碎裂電壓和碰撞能量進行優化選擇。選擇兩個豐度最高的特征離子作為定性離子，并以其中豐度較高的子離子作為定量離子，最終分別確定各化合物定量離子和定性離子質量數及質譜參數。

2.4 線性關系及檢測限

取對照品混合工作液配成一系列濃度的對照品溶液，分別進樣進行測定，以化合物峰面積（Y）和對應的濃度（X）進行線性回歸，得到15種藥物線性范圍為0.08 ng/mL～20 ng/mL，線性方程、相關系數及檢測限見表2。

表2 15種抗生素藥物線性方程、相關系數、檢測限Table 2 Regress linear formulation，relative coefficient，detection limit of 15 drugs

2.5 回收率實驗

分別稱取樣品9份，每份5 mL，按20、10、2 ng/mL濃度添加對照品溶液，每個濃度3份供試品溶液，照“1.3”項下方法制備樣品并進行測定。15種藥物回收率在71.8%～87.8%之間，相對標準偏差在2.2%～7.9%（n=9）之間，滿足試驗要求。

2.6 樣品測定結果

應用本法將收集到的4批人參蜂王漿口服液進行測定，均未檢出上述15種藥物。

3 結論

本文建立了同時測定人參蜂王漿口服液中四環素類、大環內酯類、喹諾酮類、林可胺類共15種抗生素藥物的方法。該方法操作簡便、靈敏度高，檢測限達到0.02 ng/mL～0.9 ng/mL，可滿足目前國內外動物源性食品中相應藥物殘留檢測的要求。采用串聯質譜對待測藥物進行定性定量，通過與對照品的保留時間及定性離子對豐度比的比較進行確證，避免了檢測結果的假陽性的出現。由此可見，本方法適用于人參蜂王漿口服液中藥物殘留的定性定量測定。

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