超聲波萃取-HPLC檢測飲料中DEHP的含量

劉燕偉，周真巡，趙文峰，馬彤梅，*

（1.華南理工大學化學與化工學院，廣東廣州510640；2.江蘇師范大學化學化工學院，江蘇徐州211116）

“塑化劑”又稱為鄰苯二甲酸酯類（PAEs），是一種被廣泛使用的工業增塑劑。PAEs主要用作增加塑料的可塑性和韌性，也可使油脂更好地分散到水中，起乳化、增稠作用[1]。PAEs其對人體的危害性遠遠大于三聚氰胺[2-4]，在體內長期積累會導致畸形、癌變和突變[5-6]；而其中的鄰苯二甲酸二（2-乙基）己基酯（DEHP）對幼兒帶來的潛在危害會更大，食用后果可能會造成小孩性別錯亂，包括生殖器變短小、性征不明顯[7]。

塑化劑與塑料分子的相溶性較好，兩者間沒有嚴密的化學結合鍵，而是由氫鍵或范德華力連接，彼此保持各自獨立的化學性質。當塑料制品接觸到水、油脂等時，其中的塑化劑便會遷移入水中，從而造成了對水、食物等污染[1，8-9]。目前，市場上很多飲料都采用塑料瓶包裝，在為消費者提供方便的同時也帶來了食品安全隱患。

目前，檢測食品及塑料制品中PAEs含量的方法較多，而檢測飲料中PAEs的方法較少，其中檢測DEHP的方法更少。因此，建立一種快速、簡便測定飲料中DEHP含量的方法是很必要的。目前國內外測定食品中DEHP主要采用的檢測方法是GC/MS[10-12]，我國的國標也采用該方法[13]。GC/MS具有重復性好、定性準確等優點[14]，但由于GC/MS價格昂貴，且其檢測器容易受污染等原因，越來越多的研究者開始使用HPLC技術檢測樣品中DEHP的含量[15-16]，且HPLC適用于檢測DEHP等具有高沸點的化合物。目前，常見提取樣品中塑化劑主要有超聲波輔助提取[17]、索氏萃取[18]、微波提取[19-20]、快速溶劑萃取[21]等技術，為了使樣品中塑化劑提取得更充分，通常需要較長的處理時間。

本研究建立了采用超聲波輔助水浴提取-HPLC檢測飲料中DEHP的含量。水浴加熱超聲提取取代室溫條件下提取飲料中的DEHP，極大地縮短了超聲時間、提高了萃取效率。采用HPLC-UV檢測提取液中DEHP的含量，取得了滿意的實驗結果。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

Summit 680型高效液相色譜儀（紫外檢測器，美國 Dionex Inc）；Pyramid水系 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm，北京振翔公司）；離心機（TDL-80-2B，上海安亭科學儀器廠）；旋轉蒸發儀（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）；超聲清洗器（KQ-100E，昆山市超聲儀器有限公司）；電子天平（Sartorius，賽多利斯科學儀器有限公司）；過濾膜（Nylon66 0.22 μm，上海全島公司）。

鄰苯二甲酸二（2-乙基）己基酯（DEHP）為標準品（Sigma公司，色譜純），乙腈、甲醇（天津四友公司，色譜純），正己烷、丙酮、乙酸乙酯、環己烷、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純試劑。所用水為二次蒸餾水，所用玻璃儀器均在二次蒸餾水沖洗后，烘干5 h。本試驗避免使用塑料器具。

1.2 標準溶液的配置

稱量10 mg的DEHP標品于10 mL的容量瓶中，用甲醇定容，配置1 000 mg/L的儲備液。將儲備液用甲醇稀釋，分別配置濃度為 0.05、0.5、1、2、5 mg/L 的系列標準溶液。

1.3 液相色譜條件

Pyramid水系 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）；流動相：乙腈與水（體積比為 95 ∶5），流速：0.6 mL/min，柱溫：30℃，檢測波長為 224 nm，進樣量：20 μL；

1.4 樣品的前處理

量取體積為2 mL的樣品置于三角燒瓶中，分別加入0.06 g氯化鈉，5 mL的正己烷于40℃的水溫下超聲波輔助提取10 min，在3 500 r/min下離心15 min；取上層正己烷提取液2 mL，在低于40℃的條件下，旋轉蒸發至干后用甲醇溶解定容于2 mL的容量瓶中。經0.22 μm濾膜過濾，注入HPLC色譜儀中。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的優化

2.1.1 提取液的選擇

DEHP難溶于水，易溶于乙腈、甲醇等有機溶劑。本文考察了乙腈、甲醇、正己烷、環己烷、乙酸乙酯、丙酮等有機溶劑對樣品中DEHP的提取效果，結果見圖1。

圖1 溶劑的選擇Fig.1 Effect of extracting solvent

結果表明：在同樣的實驗條件下，使用正己烷作為提取液，效果更好。

2.1.2 鹽效應影響

NaCl通過鹽析作用可以促使樣品中DEHP進入正己烷層。本實驗通過分別向樣品中加入0～0.1 g的NaCl，考察加入鹽的量對提取DEHP效果的影響。實驗結果表明，加入0.06 g的NaCl時，得到的目標物含量較高。結果見圖2。

圖2 NaCl鹽效應的影響Fig.2 Salting effect of NaCl

2.1.3 提取液體積的選擇

本實驗在2 mL樣品體積中，加入正己烷提取液的體積在3 mL～7 mL范圍內變化，通過對提取效果的比較，選擇最佳正己烷的體積。實驗結果表明，當加入正己烷的體積為5 mL時，提取目標物的含量最高。結果見圖3。

圖3 不同體積正己烷的影響Fig.3 Effect of the volume of n-hexane

2.1.4 超聲時間的選擇

本實驗采用超聲波輔助提取技術，超聲提取速度快、容易操作。文獻報道一定超聲條件可導致PAEs降解[22]。因此，我們在采用超聲提取時，注意控制超聲頻率、功率及超聲時間。在室溫的條件下，超聲35 min，提取效果最佳。溫度的提高可以加速DEHP的提取，本實驗又考察了控溫在40℃的條件下，超聲10 min達到的效果優于在不控溫下超聲35 min的結果，但將溫度繼續升至60℃時，萃取的效果反而下降。圖4所示，本實驗采用的超聲提取條件為超聲頻率40 kHz，功率200 W，控溫40℃下，超聲提取10 min。

圖4 不同溫控和不同超聲時間的影響Fig.4 Effect of the ultrasonic time and temperature

2.1.5 溶液pH的影響

在一定的條件下，溶液酸堿性影響著有機化合物的提取。在本實驗中，考察具有不同的pH條件下，對DEHP提取效果的影響。實驗結果見圖5可知，當pH為5時，提取效果最佳。

2.1.6 離心時間的影響

一般情況下，離心時間增長，有助于樣品的分離和凈化。但離心時間過長時，目標物可能會聚沉，反而不利于樣品的分離。因此，分別對樣品采取在5 min～25 min不同范圍的離心時間進行考察。實驗表明，在3 500 rpm的條件下離心15 min效果最佳。結果見圖6。

圖5 不同pH條件下的提取效果Fig.5 Effect of pH on extraction efficency

圖6 不同離心時間的影響Fig.6 Effect of the centrifugal time

2.2 標準曲線

在最優實驗條件下，分別對濃度為 0.05、0.5、1、2、5 mg/L的標準溶液進樣得到相應的液相色譜圖，圖7不同濃度標準溶液的液相色譜圖。圖8中，以DEHP濃度（mg/L）為橫坐標，以對應濃度的峰面積為縱坐標，擬合線性回歸方程為Y=0.749 45*X+0.072 83，相關系數R為0.999 95。結果表明：該方法在0.05 mg/L～5 mg/L的濃度范圍內線性相關性良好；由3倍信噪比（S/N=3），得到該方法中DEHP的最低檢測限（LOD）為0.000 5 mg/L。

圖7 不同濃度的DEHP標準溶液的色譜圖Fig.7 Chromatograms of standard solution of DEHP

圖8 DEHP標準溶液的標準曲線Fig.8 Calibration curve of standard DEHP

2.3 添加回收率和精密度

準確添加不同濃度DEHP的標準溶液至樣品中，按照1.4所述對樣品進行處理，在優化的實驗條件下進液相色譜儀測定，考察方法的精密度（RSD）和回收率，得到方法的回收率在90.2%～101%之間，RSD為2.32%～5.17%之間。結果如表1所示，每個添加水平做7次平行實驗。

表1 不同添加水平下飲用水中DEHP的回收率及RSD（n=7）Table 1 Recoveries and RSD of DEHP in the water with different amounts（n=7）

我們將本實驗采用的方法與已經報道的一些常用檢測各類飲料中DEHP方法的最低檢測限和RSD進行比較，如表2所示。

表2 本實驗與已有文獻檢測方法的比較Table 2 Comparison of the presented method with some previously reported works

通過對比表明多數研究小組采用MS檢測方法測定飲料中的DEHP，而我們采用成本較低的HPLC；同時我們的實驗方法得到非常低的檢測限，適用于檢測DEHP含量較低的飲料，且本實驗有較好的RSD，對檢測飲料中DEHP的含量具有一定的可靠性。

2.4 實際樣品的測定

在最優實驗條件下，將處理好的實際樣品進高效液相色譜儀，得到液相色譜圖，圖9中（a）為汽水樣品的色譜圖，（b）為汽水樣品中加標的色譜圖。通過加標樣品和標準溶液進液相色譜，從而確定該飲料樣品色譜圖中目標峰的出峰時間為14.70 min，定量其濃度為0.289 mg/L。由圖9可知，本文建立的方法能夠實現樣品中DEHP與基體中其他組分很好的分離。

圖9 汽水樣品（a）及其加標樣品（b）液相色譜圖Fig.9 Liquid chromatograms of drinks（a）and adding standard（b）

我們用建立的方法分析了多種不同類型飲料樣品，每個樣品做7次平行實驗，檢測結果見表3。

表3 各類飲料樣品的分析結果（n=7）Table 3 Analytical results of several different kinds of drink samples（n=7）

實驗結果表明汽水飲料樣品中DEHP的檢測含量在0.127 mg/L～0.289 mg/L之間，RSD 為 3.43%～6.31%之間。本實驗對塑料瓶和易拉罐不同包裝的汽水均檢測出少量的DEHP，而塑料包裝的汽水中DEHP的含量約為易拉罐包裝的2倍。易拉罐包裝的汽水中的DEHP可能是由于在生產過程中接觸到塑料材質而引入的。

3 結論

本文建立了加熱超聲提取-HPLC方法檢測飲料中DEHP的含量。40℃下加熱輔助超聲萃取具有縮短了萃取時間、提高了萃取效果等優勢。實驗結果表明，DEHP在0.05 mg/L～5 mg/L濃度范圍內線性關系良好，相關系數R=0.999 95；檢測限為0.000 5 mg/L；加標回收率為90.2%～101%；相對標準偏差（RSD）為2.32%～5.17%。該方法簡便、快速、可靠、高靈敏、分離度較好等特點，適用于飲料中DEHP含量的測定。

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