紫色甘薯原花青素抑菌效果的研究

陳嬋，丁玲，黃瓊，彭宏

（福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建福州350119）

紫色甘薯由于富含花青素等一類對(duì)人體營(yíng)養(yǎng)的保健物質(zhì)而在近年被認(rèn)定為特用品種。近年來的研究表明，從紫色甘薯的塊根中浸提的色素是一種優(yōu)質(zhì)的天然食用花青素類色素，色澤鮮亮自然，無毒，無特殊氣味，具有多種營(yíng)養(yǎng)、藥理和保健功能[1-3]。

甘薯塊根花青素具有色素和抑菌雙重功能，是理想的功能性天然色素。目前已有人初探了有關(guān)甘薯花青素抑菌活性，如王關(guān)林[4]等研究了甘薯花青素的提取及其抑菌效果分析，結(jié)果表明了甘薯塊根花青素對(duì)3種常見致病菌均有抑菌作用，并與其濃度呈正相關(guān)。古榮鑫[5]等用涂布涂板法對(duì)花青素抑菌活性進(jìn)行初步測(cè)定，結(jié)果表明：發(fā)現(xiàn)花青素對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。本文進(jìn)一步深入研究了紫色甘薯原花青素對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌以及青霉菌等幾種常見有害菌的抑菌作用，主要研究了不同質(zhì)量濃度的紫色甘薯原花青素對(duì)供試菌的抑菌效果，并比較了紫色甘薯原花青素和尼泊金乙酯、苯甲酸鈉、山梨酸鉀等常見食品防腐劑的抑菌效果，為紫色甘薯原花青素今后的進(jìn)一步開發(fā)及應(yīng)用提供了理論參考，也為尋找天然防腐劑提供新的理論參考。

1 材料及儀器

1.1 材料

紫色甘薯；市售。

甲醇、正丁醇、鹽酸、硫酸鐵銨、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、尼鉑金乙酯鈉、山梨酸鉀、苯甲酸鈉均為分析純。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、青霉菌由福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器

JA1103電子天平：上海民橋電子儀器廠；722可見光度計(jì)：上海天翔光學(xué)儀器有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海申賢恒溫設(shè)備廠；LDZX-40A1壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；BCM-1300A生物潔凈型標(biāo)準(zhǔn)潔凈工作臺(tái)：廣州市深華實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫色甘薯原花青素的提取及制備

選用新鮮，無病蟲害，無腐爛的紫色甘薯，用水洗凈，去皮，稱取一定重量的紫色甘薯，粉碎，置于試管中各加入5 mL 80%乙醇溶液，然后置于60℃的恒溫水浴鍋中，加熱2 h，取上清液，再用80%乙醇溶液定容到25 mL容量瓶中，備用。

1.3.2 紫色甘薯原花青素的測(cè)定方法

取上述溶液0.2 mL分別置于6支具塞比色管中，各加入甲醇溶液至1.0 mL然后加入6.0 mL正丁醇/鹽酸（95/5，體積比）和0.2 mL 2%鹽酸鐵胺溶液（臨時(shí)配用），搖勻后，于沸水中加熱40 min，然后迅速冷卻，在550 nm測(cè)定吸光度。

1.3.3 菌體的培養(yǎng)方法

1.3.3.1 培養(yǎng)基的制備方法

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基的制備（100 mL），牛肉膏 0.3 g～0.5 g，瓊脂 2.0 g，蛋白胨 1.0 g，氯化鈉 0.5 g，蒸餾水100 mL，調(diào)pH在7.2～7.4之間，并在121℃下滅菌30 min。待冷卻后，倒入無菌培養(yǎng)皿。

馬鈴薯培養(yǎng)基的制備（100 mL），馬鈴薯切成小塊，稱30 g，加適量的蒸餾水在電爐上煮沸煮爛，過濾得濾液，然后準(zhǔn)確稱取2 g蔗糖和2 g瓊脂加適量蒸餾水和馬鈴薯溶液混合后加水至100 mL后將其加熱融化，分裝后，121℃滅菌25 min。傾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培養(yǎng)基中。

1.3.3.2 菌種的活化及菌懸液的制備

在無菌室的超凈工作臺(tái)上將供試菌種接至各自的試管斜面培養(yǎng)基中，放入恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，其中細(xì)菌 37℃，24 h～36 h；霉菌 29℃，48 h～60 h。在無菌室的超凈工作臺(tái)上，用接種環(huán)分別挑取少量活化的菌種放入無菌水中，制成菌體或孢子濃度為104CFU/mL～105CFU/mL的菌懸液，用振蕩器震蕩均勻，備用。

1.3.3.3 抑菌圈大小的測(cè)定[6-7]

抑菌圈的測(cè)定采用濾紙片擴(kuò)散法。將普通濾紙用打孔器打成直徑為6 mm的濾紙片，放入干燥潔凈的培養(yǎng)皿內(nèi)，經(jīng)121℃，20 min高壓滅菌后放入干燥箱內(nèi)干燥.將干燥后的濾紙片一部分放入不同濃度的紫色甘薯原花青素溶液中浸泡1 h制成藥敏紙片備用，另一部分放入無菌生理鹽水中和80%的乙醇溶液中浸泡做空白對(duì)照。在超凈工作臺(tái)上將滅菌后的培養(yǎng)基倒平板，分別取菌體密度104cfu/mL的菌懸液0.2 mL均勻涂布于各平板上，待30 min后，用無菌鑷子夾取備好的濾紙片緊貼在含菌培養(yǎng)基表面，每皿等距貼2片。每種濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，將平板倒置于一定溫度下一定時(shí)間后取出，用卡尺測(cè)量抑菌圈直徑.

1.3.4 紫色甘薯原花青素對(duì)不同供試菌的抑菌作用

選用直徑為6 cm的培養(yǎng)皿，每皿加大約15 mL經(jīng)滅菌處理的培養(yǎng)基，待冷卻凝固后，放置于培養(yǎng)箱中觀察24 h，然后將有雜菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿廢棄，在無雜菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中每皿加入供試菌懸液0.2 mL，涂布均勻后，用無菌鑷子夾取制備好的濾紙片貼于含菌培養(yǎng)基上，每皿放置2片，各紙片間的距離均等，每一樣品重復(fù)3次，倒置培養(yǎng)。同時(shí)用浸有無菌水的濾紙片以及80%乙醇作空白對(duì)照.其中細(xì)菌37℃，24h～36h；霉菌29℃，48 h～60 h。觀察抑菌圈，用游標(biāo)卡尺量取各個(gè)培養(yǎng)皿的抑菌圈直徑，抑菌圈直徑越大，抗菌活性越強(qiáng)。

1.3.5 不同質(zhì)量濃度紫色甘薯原花青素對(duì)不同菌的抑菌作用[8-9]

根據(jù)1.3.1的方法提取紫色甘薯原花青素，備用。把紫色甘薯原花青素在無菌條件下配成質(zhì)量濃度為5、10、15、20、30 mg／mL 的原花青素溶液，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。按照1.3.4的方法測(cè)量不同濃度的抑菌圈直徑，得出不同質(zhì)量濃度的紫色甘薯原花青素抑菌作用的強(qiáng)弱。

1.3.6 紫色甘薯原花青素與尼泊金乙酯、苯甲酸鈉、山梨酸鉀抑菌效果比較

根據(jù)1.3.1的方法提取紫色甘薯原花青素，制成10 mg/mL的原花青素溶液，備用。分別配制0.5 μg/mL尼泊金乙酯以及5 μg/mL苯甲酸鈉、山梨酸鉀溶液，搖勻，備用。

將培養(yǎng)基傾注無菌平皿。冷卻后，用無菌移液管吸取0.2 mL菌懸液至平板上，用無菌三角玻璃涂棒涂布均勻。待干后，將小濾紙片分別置于紫色甘薯原花青素、尼泊金乙酯、苯甲酸鈉、山梨酸鉀溶液中浸泡，晾干，放入平板中。倒置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)一定時(shí)間（其中細(xì)菌 37℃，24 h～36 h；霉菌 29℃，48 h～60 h）。最后測(cè)定抑菌圈直徑大小。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析與處理

采用DPS2000對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan新復(fù)極差法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫色甘薯原花青素含量的測(cè)定

經(jīng)線性回歸方程可得：測(cè)定紫色甘薯原花青素含量的公式為Y=0.055 3A-2.488×10-3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0。可計(jì)算紫色甘薯原花青素的質(zhì)量濃度。

2.2 紫色甘薯原花青素對(duì)不同供試菌抑菌作用的影響

表1列出了質(zhì)量濃度為10 mg/mL紫色甘薯原花青素溶液對(duì)不同致病菌的抑菌效果。

表1 10 mg/mL紫色甘薯原花青素對(duì)不同供試菌抑菌作用的影響Table 1 Inhibition efect of 10 mg/mL purple sweet potato proanthocyandins against the tested microorganisms

結(jié)果表明：對(duì)照組無菌生理鹽水對(duì)4種受試菌沒有抑菌作用，而80%的乙醇溶液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及沙門氏菌有一定的抑菌圈，對(duì)青霉菌沒有抑菌作用，而紫色甘薯原花青素對(duì)供試菌卻有較好的抑菌效果，每種菌的抑菌效果各異。其中，同濃度下紫色甘薯原花青素對(duì)沙門氏菌的抑菌效果最好，抑菌圈達(dá)到17.1 mm；對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈分別為14.4和15.5 mm；對(duì)青霉菌沒有抑菌效果。由此得出紫色甘薯原花青素的抑菌效果為沙門氏菌＜金黃色葡萄球菌＜大腸桿菌＜青霉菌。

2.3 不同質(zhì)量濃度紫色甘薯原花青素對(duì)不同供試菌抑菌效果

表2列出了不同質(zhì)量濃度紫色甘薯原花青素對(duì)不同供試菌抑菌效果。

表2 不同質(zhì)量濃度紫色甘薯原花青素對(duì)供試菌的抑菌效果Table 2 Inhibition effect of different concentrations on purple sweet potato proanthocyandins against the tested microorganisms

從表2得出不同質(zhì)量濃度紫色甘薯原花青素對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的抑菌作用隨著原花青素濃度的提高，抑菌圈增大，抑菌作用增強(qiáng)。而對(duì)青霉菌而言，只有高濃度的紫色甘薯原花青素才對(duì)青霉菌有一定的抑菌作用。由此可知：紫色甘薯原花青素對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的抑菌作用的抑菌效果是與紫色甘薯原花青素濃度的成正相關(guān)，當(dāng)濃度增加時(shí)，抑菌效果也越好。

2.4 比較紫色甘薯原花青素與尼泊金乙酯納、苯甲酸鈉、山梨酸鉀對(duì)不同供試菌的抑菌效果

尼泊金乙酯納、苯甲酸鈉、山梨酸鉀均為食品中常見的添加劑，本文參照食品添加劑的使用用量配制一定濃度的添加劑溶液作為紫色甘薯原花青素的陽性對(duì)照。其中尼泊金乙酯配制為0.5 μg/mL，苯甲酸鈉、山梨酸鉀配制為5 μg/mL。表3比較了10 mg/mL的紫色甘薯原花青素與三種常用添加劑對(duì)不同供試菌的抑菌效果。

表3 紫色甘薯原花青素、尼泊金乙酯、苯甲酸鈉、山梨酸抑菌作用的比較Table 3 The comparison of inhibitory effect on purple sweet potato proanthocyandins，ethylparaben，sodium benzoate and sorbic acid mm

結(jié)果表明紫色甘薯原花青素對(duì)所試大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及沙門氏菌具有較好的抑制作用，抑菌圈直徑均為15 mm以上，抑菌效果顯著，抑菌效果隨著不同供試菌的不同而有所不同，雖然10 mg/mL紫色甘薯原花青素的抑菌效果不如濃度為5 μg/mL山梨酸鉀，但與5 μg/mL苯甲酸鈉與0.5 μg/mL尼泊金乙酯的抑菌效果相當(dāng)，該數(shù)據(jù)為紫色甘薯原花青素的抑菌能力提供了理論依據(jù)。但紫色甘薯原花青素對(duì)青霉菌沒有抑菌作用，而其他陽性對(duì)照都有較好的抑菌圈，說明紫色甘薯原花青素對(duì)霉菌的抑菌效果不理想。

3 結(jié)論

1）經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究表明，從紫色甘薯中提取的原花青素對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌有明顯的抑菌作用，抑菌效果與紫色甘薯原花青素的濃度呈正相關(guān)，紫色甘薯原花青素對(duì)青霉菌的抑菌較差，只有在高濃度時(shí)才有一定的抑菌作用。

2）10 mg/mL紫色甘薯原花青素對(duì)所試大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及沙門氏菌的抑菌效果同0.5 μg/mL的尼泊金乙酯以及5 μg/mL的苯甲酸鈉的抑菌作用相當(dāng)，而不如5 μg/mL的山梨酸鉀。紫色甘薯原花青素可作為抑菌劑進(jìn)行進(jìn)一步開發(fā)利用。

3）由于山梨酸鉀和苯甲酸鈉在pH為2.5～4.0的環(huán)境中抑菌效果較好，而本實(shí)驗(yàn)條件下pH為7.2～7.4，抑菌效果受到一定的影響。紫色甘薯原花青素具有無殘留、毒性小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，因此，在食品中有可能代替化學(xué)防腐劑和保鮮劑對(duì)食物進(jìn)行保鮮，有很好的開發(fā)潛能。

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