蘋果酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元的工藝研究

于麗穎，成樂琴

（吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林 132022）

大豆異黃酮的健康功效多種多樣，可以預防多種疾病和改善骨健康狀況[1]。大豆中天然存在的異黃酮包括大豆異黃酮糖苷和大豆異黃酮苷元兩類，其中，大豆異黃酮糖苷占到了總異黃酮含量的80%～95%以上，糖苷型大豆異黃酮由于分子較大，食用后不能被人體直接吸收，一般是在體內消化酶作用下轉化為苷元被人體吸收，但目前保健品大豆異黃酮各種類型主要成分是糖苷，資料顯示[2-4]，體內消化酶一般水解率在20%～40%，產品功效較低。另外，每個人腸道消化酶不太一樣，也就是說，因人而異，即使食用同樣的大豆異黃酮，效果相差也會很大。因此體外水解工藝開發就具有實際意義。目前，大豆異黃酮糖苷轉化苷元的方法[5-9]最常用的是酸催化法、堿催化法、酶催化法。酸水解通常用鹽酸、硫酸作催化劑，強酸條件下水解同時對大豆異黃酮苷元的穩定性有所影響。堿催化產物苷元容易降解，應用受到很大限制。酶水解法具有水解條件溫和、產物穩定性好、純度高等特點，但酶生產成本很高，而且酶不容易重復利用，需要進一步研究低成本的酶固化技術。用蘋果酸做催化劑來催化大豆異黃酮糖苷的水解，避免目前工業上的水解方法對設備的腐蝕，水解產物無需分離直接用于功能性食品，彌補了現有大豆異黃酮轉化苷元工藝中選用鹽酸催化、堿催化和酶催化等技術缺陷，因此是一條應用價值較高的工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆異黃酮糖苷標樣 大豆苷，黃豆黃苷、染料木苷，大豆苷元，黃豆黃素，染料木素，含量超過98%，購天津馬克生物有限公司；糖苷型大豆異黃酮提取物 含量為91.3%，購西安金綠生物工程公司。

高效液相色譜儀 大連依利特分析儀器有限公司；分析天平 北京醫用天平廠；CS101-3型電熱鼓風干燥箱 重慶實驗設備廠；KQ-250VDE型雙頻數控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

稱取大豆異黃酮糖苷50mg置于50mL圓底燒瓶中，加入一定濃度蘋果酸水溶液10mL，超聲水浴1h，超聲頻率45kHz，水浴溫度75℃。反應液轉移到高壓釜中，反應溫度為110～130℃，反應時間為0.5～2h，反應結束后，冷卻反應液到室溫。將冷卻后具有部分析出的反應液用5mL甲醇全部溶解后，取一定量反應液用甲醇稀釋到100μg/mL，過0.45μm濾膜后上機測其糖苷的含量，通過單因素和正交實驗確定最佳水解條件。

1.3 糖苷及其苷元含量的測定

色譜條件：色譜柱：Shimadzu VP-ODS C18柱，150mm×4.6mm，5μm；流動相A：0.4%磷酸水溶液；流動相B：甲醇；梯度洗脫程序：0～10min，30%～35%B；10～20min，35%～40%B；20～30min，40%～55%B；30～40min，55%～65%B。流速：1mL/min；檢測波長為：260nm，測定溫度為30℃；進樣量：20μL。

根據糖苷和苷元化學性質的不同，從色譜柱中流出的先后順序不同，經紫外檢測器測定，通過與標準品比較，以保留時間定性、峰面積定量、外標法計算。

大豆異黃酮糖苷水解率（%）=水解前后大豆異黃酮糖苷含量之差/水解前大豆異黃酮糖苷含量×100

1.4 單因素實驗設計

1.4.1 水解溫度的選擇 實驗分別選擇110、115、120、125、130℃為水解溫度，在蘋果酸溶液濃度為2.0mol/L，水解時間2.5h的條件下水解，按照1.2的步驟操作，計算大豆異黃酮糖苷水解率。

1.4.2 蘋果酸水溶液濃度的選擇 實驗分別選擇0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mol/L的蘋果酸水溶液為催化劑，水解溫度125℃，水解時間2.5h的條件下水解，按照1.2的步驟操作，計算大豆異黃酮糖苷水解率。

1.4.3 水解時間的選擇 實驗分別選擇0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h為水解時間，在蘋果酸水溶液濃度為2.0mol/L，水解溫度125℃的條件下水解，按照1.2的步驟操作，計算大豆異黃酮糖苷水解率。

1.5 正交實驗設計

在單因素實驗的基礎上，采用正交實驗方法，優化大豆異黃酮糖苷水解苷元的工藝。以水解率為考察指標，選擇反應溫度（120、125、130℃）、反應時間（2.0、2.5、3.0h）、蘋果酸濃度（1.5、2.0、2.5mol/L）作為考察因素，按三因素三水平進行正交實驗設計L9（43），見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 The factor level table of orthogonal experiment

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 不同反應溫度對大豆異黃酮水解率的影響實驗結果如圖1所示。

圖1 不同反應溫度對水解率的影響Fig.1 Effect of different reaction temperature on hydrolysis rate

實驗結果表明，隨著溫度增加，水解率逐漸增加。當反應溫度為125℃，水解率達到90.4%，一般大豆異黃酮糖苷在人體消化酶作用下，水解率為20%左右，大豆異黃酮糖苷水解率達到90%更具有實際意義。因此，在單因素水解反應實驗中，適宜溫度為125℃。為了進一步考察反應溫度對大豆異黃酮糖苷水解率的影響，選擇反應溫度分別為120、125、130℃進行正交實驗。

2.1.2 不同蘋果酸水溶液濃度對大豆異黃酮糖苷水解率的影響 實驗結果如圖2所示。

圖2 不同催化劑蘋果酸水溶液濃度對水解率的影響Fig.2 Effect of different concentrations of catalyst malic acid on hydrolysis rate

實驗結果表明，隨催化劑蘋果酸水溶液濃度的增加，水解率逐漸增加，然后降低；當蘋果酸濃度為2.0mol/L時，水解率為90.4%，再增加酸濃度，水解率有所降低，可能的原因，蘋果酸為有機弱酸，適宜的濃度酸性較強，濃度過大會抑制其電離，從而減弱酸性，所以適宜的蘋果酸濃度為2.0mol/L。為了進一步考察催化劑濃度對大豆異黃酮糖苷水解率的影響，選擇蘋果酸濃度分別為1.5、2.0、2.5mol/L進行正交實驗。

2.1.3 不同反應時間對大豆異黃酮糖苷水解率的影響 實驗結果如圖3所示。

實驗結果表明，隨反應時間增加，水解率也逐漸增加；當反應時間為2.5h，水解率達到90.4%，延長時間，水解率變化不大。為了進一步考察反應時間對大豆異黃酮糖苷水解率的影響，選擇反應時間時間分別為2.0、2.5、3.0h進行正交實驗。

圖3 不同反應時間對水解率的影響Fig.3 Effect of different reaction time on hydrolysis rate

2.2 正交實驗確立優化實驗條件

2.2.1 正交實驗結果 按正交實驗表進行實驗，結果見表2。

表2 正交實驗結果分析表Table 2 The result analysis of orthogonal experiment

根據表2實驗結果，進行方差分析見表3[10]。

表3 蘋果酸水解正交實驗方差分析表Table 3 The variance analysis of orthogonal experiment in the malic acid hydrolysis

從表2的極差分析結果可知，三因素對水解率的影響程度依次為A＞B＞C，三因素的最佳水平組合為A3B3C2，即蘋果酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元的最佳工藝條件為：反應溫度130℃，反應時間為3.0h，蘋果酸水溶液濃度為2.0mol/L，水解率達到94.0%以上。表3的方差分析結果表明，水解溫度和水解時間對大豆異黃酮糖苷的水解效果具有顯著影響。

2.2.2 最佳工藝驗證實驗 為了考察上述優選工藝的穩定性，按該工藝條件重復提取3次，測得大豆異黃酮糖苷的水解率分別為94.8%、95.1%、94.2%，平均為94.7%，表明本實驗優選的工藝穩定可靠。

大豆異黃酮標準品、原料及水解后樣品的液相色譜分析圖見圖4。

圖4 大豆異黃酮標準品、原料及水解后樣品的液相色譜分析圖Fig.4 Liquid chromatographic analysis of soybean isoflavones standard,raw material and hydrolysis sample

由圖4液相色譜分析結果表明，根據保留時間，對應A和B，水解產物C中峰1和峰3信號基本消失，峰2僅有微弱的信號峰，與此同時，峰4～峰6相應增加，說明蘋果酸對大豆異黃酮糖苷顯示出較強的水解能力。

3 結論

在單因素實驗基礎上，通過正交實驗優化蘋果酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元的工藝條件，以大豆異黃酮糖苷的水解率作為評價指標，得出各因素對水解效果影響的主次順序依次為反應溫度＞反應時間＞蘋果酸水溶液濃度。通過極差分析可知，反應溫度對水解率影響顯著。大豆異黃酮糖苷水解的最佳工藝條件為反應溫度130℃，反應時間3.0h，催化劑蘋果酸水溶液濃度2.0mol/L，在此條件下所得的大豆異黃酮糖苷水解率達到94.7%，達到和超過目前一般文獻報導大豆異黃酮糖苷水解率。

本課題成功地探索出了一條簡便、清潔、成本較低，水解產物無需后處理直接用于功能性食品的綠色合成工藝路線，彌補了現有工藝中的技術缺陷，因此實用性較高。

[1]Lun C K，Kung T L.Cloning，expression，and characterization of two β -glucosidases from isoflavone glycoside—hydrolyzingBacillus subtilisnatto[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56：119-125.

[2]Kawakami Y，Tsurugasaki W，Nakamura S，et al.Comparison of regulative functions between dietary soy isoflavones aglyeone and glucoside on lipid metabolism in rats fed cholesterol[J].Journal of Nutrition Biochemistry，2005，16：205-212.

[3]Setchell K D R，Cassidy A.Dietary isoflavones：biological effects and relevance to human healthr[J].Journal of Nutrition，1999，129：758S-767S.

[4]張遜，姚文，朱偉云.腸道大豆異黃酮降解菌研究進展[J].世界華人消化雜志，2006，14（10）：973-978.

[5]高榮海，鄭艷，劉長江.大豆異黃酮糖苷酸法水解工藝的研究[J].糧食加工，2008，3（1）：54-57.

[6]孫艷梅，張永忠，許晶，等.黑曲霉β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷研究[J].東北農業大學學報，2007，38（1）：9-12.

[7]孫體健，王浩江，曹曉峰，等.發酵法水解大豆異黃酮提取條件的研究[J].食品研究與開發，2006，27（4）：11-12.

[8]孟憲文，李長彪，劉長江，等.乳酸菌β-葡萄糖苷酶的分離純化及特性研究[J].食品科學，2006，27（11）：116-119.

[9]王振麗，李莉.利用微生物代謝酶轉化大豆異黃酮的研究[J].食品研究與開發，2006，27（8）：196-198.

[10]羅傳義，時景榮.實驗設計與數據處理[M].吉林：吉林人民出版社，2002：210-212.