低鹽腌制大頭菜腐敗菌的分離與初步鑒定

胡懷容，張 慶，2，鮮欣言，唐 萍，張友華，蔣夢琳，李明元，2，*

（1.西華大學生物工程學院，四川省食品生物技術重點實驗室，四川成都 610039；2.西華大學古法發酵（釀造）生物技術研究所，四川成都 610039；3.宜賓戎陳坊食品有限公司，四川宜賓 644000）

大頭菜學名芥菜，十字花科二年生草本植物，是中國著名的特產蔬菜。除高寒和干旱地區外，大頭菜在我國不存在分布邊界，為全國各地栽培的常用蔬菜，其富含VA、胡蘿卜素，但由于其組織堅脆且具有刺激舌頭和鼻竇的芥辣味，不宜鮮食，常被制成腌制品。腌制大頭菜作為我國傳統的腌制加工蔬菜，名聞全國，享有較大的聲譽，深受廣大消費者喜愛，是人們日常生活的消費食品。

目前大頭菜生產總體處于粗放作坊式加工狀態，以傳統自然發酵工藝為主，生產技術相對較落后，勞動密集型產業較多[1]。在傳統工藝下，缺乏操作規范，往往造成產品貨架期短、腐敗變質嚴重和質量不統一。為滿足人們低鹽飲食的需求，大量廠家不惜大量加入超過國家標準的防腐劑。袋裝醬腌菜，尤其是低鹽的醬腌菜在貯、運、銷過程中易被有害微生物污染，發生腐敗變質[2]。本實驗針對3～5月份包裝銷售的腌制大頭菜易變質的現象，多次對不同生產批次的真空包裝腌制大頭菜感官檢測，發現兩類情況：第一類，腌制大頭菜色澤變暗、脆度降低；第二類，腌制大頭菜表面有白色物質且發粘，滋氣味發生明顯改變，發生脹袋。因此，本研究對上述兩類腐敗變質腌制大頭菜的微生物進行分離鑒定及系統發育分析，確定腐敗微生物的種類，以期為低鹽腌制大頭菜防腐保藏技術研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原材料 經高溫滅菌真空包裝后發生腐敗變質的腌制大頭菜，宜賓戎陳坊食品有限公司；培養基 孟加拉紅培養基，營養瓊脂培養基，酵母浸出粉胨葡萄糖培養基，營養肉湯；蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、瓊脂 北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂糖 購自invitrogen；E.Z.N.ATM.Gel Extraction Ki t、E.Z.N.ATM.Plasmid Mini KitⅠ 購自Omegabiotek；Premix TaqTM購自TaKaRa Biotechnology（Dalian）Co.，Ltd.；pGMT Ligation Kit試劑盒（TIANGEN VT202-01） 購自天根生化科技（北京）有限公司。

SGSP-02電熱恒溫隔水式培養箱 黃石市恒豐醫療器械有限公司；SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；LDZX-40AI立式自動壓力蒸汽滅菌鍋 上海三申醫療核子儀器廠；電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；Eppendorf PCR擴增儀，PHS-3C酸度計 方舟科技。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗原材料檢測項目

1.2.1.1 pH測定 用PHS-3C型酸度計測定產品pH，參照GB10468-89。

1.2.1.2 總酸測定 采用酸堿滴定法測定產品中的總酸度，參照GB/T12456-2008。

1.2.1.3 含鹽量的測定 直接沉淀滴定法，參照GB/T12457-2008。

1.2.1.4 對腐敗變質的腌制大頭菜感官檢查 參照SBT 10439-2007。

1.2.2 腐敗微生物的分離和形態學鑒定[3-4]在無菌操作條件下，稱取25g樣品剪碎后加入到盛有225mL無菌水三角瓶中，振蕩混勻，再以無菌水進行梯度稀釋。取10-1～10-4稀釋液于培養皿中，倒入滅菌且冷卻至45℃左右的孟加拉紅、營養瓊脂培養基，分別在30、37℃恒溫箱中培養。細菌培養14h和24h，酵母菌培養48h。選擇菌落數合適的平板，挑取單菌落反復劃線分離，純化菌株，獲得純培養物。

1.2.3 腐敗微生物基因組DNA的提取[5]采用改進的SDS-CTAB法提取基因組DNA。

1.2.4 16 S rDNA、26S rDNA的D1/D2序列的PCR擴增和產物純化[6-7]序列如下所示：

16S rDNA序列PCR反應引物：

EU27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

1490R：5′-GGTTACCT TGTTACGACTT-3′

反應條件：94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃2min，35個擴增循環；72℃ 10min。

26S rDNA的D1/D2序列的PCR反應引物：

NL1∶5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′

NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′

反應條件：94℃ 5min；94℃ 1min，52℃ 1min，72℃2min，35個擴增循環；72℃ 10min。

PCR產物經質量分數為0.7%的瓊脂糖電泳檢測后，回收PCR產物，-20℃保存備用。

1.2.5 測序及構建系統發育樹 16S rDNA序列擴增的產物電泳檢測回收后，采用pGM-T Ligation Kit試劑盒（TIANGEN VT202-01）與pGM-T載體克隆入E.coli DH5α，挑選陽性克隆子，提取重組質粒。將重組質粒和經電泳檢測回收后的26S rDNA D1/D2序列PCR擴增產物送成都博瑞克生物技術有限公司測序，將得到的序列用GenBank中 BLAST進行相似序列檢索分析，用Clustal X軟件進行多序列比對，采用MEGA 4.0軟件的鄰接法（Neighbor-joining）構建系統發育樹，分析真空包裝腌制大頭菜腐敗微生物的分類學地位。

2 結果與分析

2.1 實驗原材料檢測

以不發生腐敗腌制大頭菜為對照，對兩類變質腌制大頭菜的檢查統計結果見表1。

由表1可知，真空包裝低鹽腌制大頭菜在流通貯藏期間，發生腐敗變質的腌制大頭菜酸度、含鹽量都降低，產品外觀色澤、滋氣味發生改變。

2.2 腐敗微生物的分離和形態學鑒定

以10-2的樣品稀釋液接種平板上計數和觀察，細菌在營養瓊脂上培養14h和24h，酵母菌在孟加拉紅培養基上培養48h。通過微生物學傳統培養和劃線分離法從色澤變暗、脆度降低的第一類腐敗變質腌制大頭菜中得到7種細菌，形態學鑒定結果見表2，其中菌株6是在培養24h后分離得到，這可能是吉氏芽孢桿菌適合堿性環境，在略偏酸的環境下，長勢較慢；在滋氣味明顯改變，發粘的第二類腐敗變質腌制大頭菜中得到3種細菌，2種酵母，形態學鑒定結果見表3。

表1 低鹽腌制大頭菜感官檢查、酸度、糖及鹽含量Table 1 Sensory examination，acidity，the content of sugar and salt with Low-salinity Pickled Turnip

2.3 16S rDNA、26S rDNA的D1/D2序列的PCR擴增和產物純化

用改進的SDS-CTAB法分別提取細菌X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7和酵母Y1、Y2共9株菌的基因組DNA，以此為模板，用引物Eu27f和1490R PCR擴增16S rDNA序列，用引物NL1和NL4 PCR擴增26S rDNA的D1/D2序列。PCR產物經質量分數為0.7%的瓊脂糖電泳檢測，7株細菌進行16S rDNA全長序列的PCR擴增；2株酵母進行26S rDNA的D1/D2序列擴增后，都得到了穩定且清晰的特異條帶，片段分別大約1500bp和600bp，結果如圖1、圖2所示。

圖1 菌株的16S rDNA電泳圖譜Fig.1 PCR amplification of 16S rDNA

圖2 菌株的26S rDNA電泳圖譜Fig.2 PCR amplification of 26S rDNA

2.4 系統發育分析

將測序結果經BLAST分析多重比對后，利用MEGA4.0構建系統發育樹，得到與測序菌株親緣關系最近的菌株，結果見圖3、圖4。Stackebrandt等[8]認為當16S rRNA的序列同源性≥97%時可以認為是一個屬，序列同源性≥98%時則可以認為是一個種。從腐敗變質的真空包裝腌制大頭菜中分離得到7株細菌，2株酵母，其中5株為Bacillus屬，1株為Lysinibacillus屬，2株為Candida屬，1株為非培養細菌的同源菌。由圖3可知，菌株X5和Lysinibacillus sphaericus相似性為97%，其余菌株的相似性為99%～100%，菌株X1與芽孢桿菌屬的Bacillus sp.WPCB 165親緣關系最近，菌株X2與芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis strain Y J001親緣關系最近，菌株X3與芽孢桿菌屬的巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium strain PRE9親緣關系最近，菌株X4與芽孢桿菌屬的嗜硼芽孢桿菌Bacillus boroniphilus strain CM25親緣關系最近，菌株X5與球形賴氨酸芽孢桿菌Lysinibacillus sphaericus親緣關系最近，菌株X6與芽孢桿菌屬的Bacillus gibsonii strain S-2親緣關系最近，菌株X7與Uncultured bacterium clone GZ84親緣關系最近；由圖4可知，菌株Y1與念珠菌屬的Candida pararugosa strain UWFP-348親緣關系最近，菌株Y2與念珠菌屬的Candida zemplinina strain CEC RMe-S-7親緣關系最近。

表2 第一類腐敗變質低鹽腌制大頭菜中細菌特征Table 2 The properties of bacteria in the first spoilage Low-salinity Pickled Turnip

表3 第二類腐敗變質低鹽腌制大頭菜中細菌、酵母特征Table 3 The properties of bacteria、yeast in the second spoilage Low-salinity Pickled Turnip

圖3 細菌系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of bacteria

圖4 酵母系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of yeast

2.5 腐敗微生物分析

對腐敗變質腌制大頭菜的兩類情況進行微生物分布分析，結果見圖5、圖6。由此可知，在色澤變暗、脆度降低的第一類腐敗變質腌制大頭菜中，未分離到酵母菌，主要是芽孢桿菌屬，其中Bacillus sp.所占比列達到34%；在滋氣味明顯改變，發粘的第二類腐敗變質腌制大頭菜中，分離得到3株芽孢桿菌屬細菌和2株酵母，且2株酵母所占比列高達88%。

3 結論與討論

圖5 第一類變質腌制大頭菜微生物分布Fig.5 The distribution of microorganism in the first spoilage Low-salinity Pickled Turnip

圖6 第二類變質腌制大頭菜微生物分布Fig.6 The distribution of microorganism in the second spoilage Low-salinity Pickled Turnip

本實驗通過微生物學傳統分離培養方法，從發生腐敗變質的腌制大頭菜中，分離得到7株細菌菌株，2株酵母菌株。提取菌株基因組DNA，PCR擴增16S rDNA、26S rDNA D1/D2序列，16S rDNA序列PCR擴增產物經連接轉化反應，獲得重組質粒。將測序結果用GenBank中BLAST進行相似序列檢索分析，構建系統發育樹，發現7株細菌以Bacillus屬為主，2株酵母都為Candida屬。經革蘭氏染色，7株細菌全為陽性，其中菌株X1～X3產酸不產氣，X4～X7不產酸不產氣，菌株Y1、Y2產氣不產酸。

相關文獻報道，蔬菜腌制品中的腐敗微生物主要是芽孢桿菌屬和酵母菌，其中大多數為枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌[9-11]。本次實驗中，分離得到的腐敗微生物，與之前的報道相符，同時也存在差異性。Lysinibacillus sphaericus在色澤變暗、脆度降低的第一類腐敗變質腌制大頭菜中所占比例為9%，是其中的次優勢腐敗微生物，在以往腌菜制品的文獻中未見報道，但劉海等曾在“花殼”干辣椒中分離得到[12]；目前，關于腌菜制品中的腐敗酵母研究不多[9-10]，由酵母引起的再發酵現象，可通過加熱至60～70℃即可達到殺菌目的[13]，但酵母菌對食鹽的耐受力比細菌大得多，能耐受較低的pH[14]，本研究在低鹽腌制大頭菜中分析發現了Candida pararugosa、Candida zemplinina兩株酵母，在滋氣味明顯改變，發粘的第二類腐敗變質腌制大頭菜中占88%比例，為優勢菌株。Candida pararugosa曾在酸粥中分離得到[15]，Candida zemplinina是葡萄酒中常見的釀酒酵母菌[16-21]。

低鹽腌制大頭菜營養豐富、水分活度較高，腐敗微生物極容易生長和繁殖，加上生產加工所用輔料種類多、來源復雜，源頭污染和二次污染難以控制。如只采用傳統的高溫水浴法處理，部分耐熱微生物和產品因受熱不均遺留的微生物仍然能殘存，極容易導致腌制大頭菜發生微生物性腐敗。在工廠化的批量生產中，袋裝量、高溫滅菌溫度與時間影響滅菌效果，馮作山等[22]曾研究過，腌制大頭菜高溫滅菌溫度和時間受產品質量控制、受熱不均可能是腌制大頭菜中有酵母殘存的主要原因。本研究從腌制大頭菜分離得到的腐敗微生物主要是芽孢菌和酵母，可作為低鹽腌制大頭菜的防腐保鮮處理中的目標菌，為下一步進行滅菌工藝和防腐劑的篩選結合應用研究提供指導方向。

[1]劉達玉，董凱鋒，王衛，等.發酵大頭菜產業化生產工藝與技術[J].中國蔬菜，2012（23）：47-49.

[2]王向陽，姜麗佳.真空包裝腌蘿卜干中腐敗微生物的抑制研究[J].中國調味品，2009，34（7）：68-72.

[3]孫磊.腌制蔬菜中復合防腐劑的開發和應用研究[D].合肥：合肥工業大學，2010.

[4]東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[5]奧斯伯.精編分子生物學實驗指南[M].北京：科學出版社，2001.

[6]田偉，張琦，鄧珍珍，等.利用 16S rRNA分析傳統四川發酵泡菜中的細菌多樣性[J].食品科學，2013，34（17）：215-218.

[7]Kurtzman C P，Robnett C J.Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit（26S）ribosomal DNA partial sequences[J].Antonie van Leeuwenhoek，1998，73（4）：331-371.

[8]Stackebrandt E，Goebel B M.Taxonomic note：a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology[J].International Journal of Systematic Bacteriology，1994，44（4）：846-849.

[9]吳丹，陳健初，葉興乾，等.榨菜腐敗微生物的分離，鑒定及生物學特性研究[J].浙江大學學報：農業與生命科學版，2009，35（2）：135-140.

[10]王敏，張耀相，肖翔.高鹽醬腌菜坯致腐微生物的分離鑒定[J].中國調味品，2003（5）：19-26.

[11]付曉紅，楊迎伍，鄧偉，等.腌制蘿卜腐敗微生物的分離及其特性研究[J].食品工業科技，2008，29（8）：132-134.

[12]劉海，丁筑紅，鄭文宇，等.辣椒“花殼”主要致變細菌的分離及鑒定[J].食品科學，2013，34（1）：160-165.

[13]張爽.醬腌菜防腐保鮮技術研究進展[J].安徽農業科學，2011，39（11）：6538-6539.

[14]肖凱軍，郭祀遠.醬腌菜保鮮的初步研究[J].中國食品添加劑，1998（2）：13-16.

[15]白梅，王娟，卿蔓君，等.內蒙古西部區酸粥中酵母菌的分離鑒定及優勢菌分析[J].微生物學通報，2010，37（9）：1299-1304.

[16]Li S S，Cheng C，Li Z，et al.Yeast species associated with winegrapesinChina[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology，2010，138（1）：85-90.

[17]Alessandria V，Giacosa S，Campolongo S，et al.Yeast population diversity on grapes during on-vine withering and their dynamics in natural and inoculated fermentations in the production of icewines[J].Food Research International，2013，54（1）：139-147.

[18]Tofalo R，Schirone M，Torriani S，et al.Diversity ofCandida zemplinina strainsfrom grapes and Italian wines[J].Food Microbiology，2012，29（1）：18-26.

[19]Kraková L，Chovanová K，?eni?ová K，et al.Yeast diversity investigation of wine-related samples from two different Slovakian wine-producing areas through a multistep procedure[J].LWTFood Science and Technology，2012，46（2）：406-411.

[20]王澤舉，王汝瑱，楊瑩.幾株酵母菌的分子系統學鑒定[J].食品科學，2012，33（15）：195-200.

[21]李艷，盧君，張利中，等.沙城龍眼葡萄自然發酵過程相關酵母生物多樣性研究[J].食品科學，2009（21）：237-240.

[22]馮作山，熱合曼.袋裝醬腌菜的防腐保藏技術研究[J].新疆農業大學學報，2000，23（2）：60-62.