皮膚衰老過程中TGF-β1，2，3的表達差異

王露萍 陳煒 余丕軍 石瀟

皮膚老化過程復雜，受許多細胞因子影響，轉化生長因子β(TGF-β)可能在其中起著重要的作用。TGF-β是一類多功能細胞因子，其3種異構體的生物學功能不盡相同。與TGF-β2、3相比，TGF-β1與創傷修復的關系更為密切，對成纖維細胞及其他間葉組織來源細胞的形態發生、增殖和分化過程起著重要作用[1]；TGF-β2能夠誘導胚胎發育過程中中胚層的形成，促進毛囊等皮膚輔助結構的形成[2]；TGF-β3對角質細胞和內皮細胞的增殖具有強烈的抑制作用[3]。本實驗旨在探討TGF-β1，2，3在不同年齡SD大鼠皮膚組織中表達的變化，及其可能的生物學意義，深入揭示TGF-β與皮膚衰老過程的關系和內在規律，為進一步研究人類皮膚衰老機制提供相關動物實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及材料

采用清潔級成年雌性SD大鼠(上海斯萊克實驗動物中心)12只。其中，2月齡6只(青年組)，18月齡6只(老年組)，取頸背部4 cm×4 cm大小皮膚組織，備用。

TGF-β1抗體SC-146、TGF-β2抗體SC-90、TGF-β3抗體SC-82(Santa Cruz公司，美國)；hrp標記的山羊抗兔IgG(Jackson Immunology公司，美國)

1.2 實驗方法

采用Western blot檢測兩組大鼠皮膚樣本中TGF-β1，2，3的蛋白表達情況。

組織塊勻漿后PBS沖洗，重懸洗滌離心，收獲細胞。細胞沉淀加入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑混合液(100∶1)裂解1 h，12 000 r/min，4℃離心10 min，取上清液，加入上樣緩沖液，95℃水浴10 min，-80℃保存。比色法測定蛋白濃度，定量上樣，進行SDS-PAGE電泳1.5～2.0 h。轉膜后加一抗稀釋液(TGF-β1抗體SC-146，TGF-β2抗體SC-90，TGF-β3抗體SC-82)，稀釋濃度1∶5 000，4℃過夜。第2天PBS-T洗膜后加入稀釋的二抗，hrp標記的山羊抗兔IgG(1∶10 000)，37℃孵育1 h，PBS-T洗膜，ECL化學發光法檢測顯影。底片通過凝膠灰度分析軟件Image J進行灰度值定量。

1.3 統計學處理

實驗所得數據均采用SPSS17.0軟件進行方差齊性和正態分布檢驗，并通過單因素ANOVA分析比較均值。結果以均值±標準差表示，P0.01為差異具有統計學意義。

2 結果

TGF-β1在青年組大鼠皮膚中呈強陽性表達(Western blot灰度值相對定量1.91±0.67)，而在衰老組大鼠的皮膚組織呈陰性表達(Western blot灰度值相對定量0.14±0.09)，兩者比較差異有統計學意義(P=0.0001)，說明TGF-β1在皮膚衰老過程中的表達存在顯著差異。

TGF-β2在青年組Western blot灰度值相對定量為0.16±0.07，衰老組該值為0.1±0.04，均呈陰性表達(P=0.17)。

TGF-β3在青年組Western blot灰度值相對定量為0.95±0.20，衰老組該值為0.80±0.26，均呈陽性表達(P=0.26)(圖1-4)。

圖1 TGF-β1蛋白電泳(Western blot)Fig.1Expression of TGF-β1 by western blot

圖2 TGF-β2蛋白電泳(Western blot)Fig.2Expression of TGF-β2 by western blot

圖3 TGF-β3蛋白電泳(Western blot)Fig.3Expression of TGF-β3 by western blot

圖4 TGF-β1，2，3蛋白相對定量Fig.4Relative quantification of TGF-β1,2,3

3 討論

皮膚衰老是一個復雜的、多因素作用引起的一系列功能與美學改變的過程，與遺傳、免疫、自由基、成纖維細胞、細胞外基質、細胞因子等諸多因素有關。老化皮膚的組織學改變主要表現為膠原蛋白減少和彈性纖維片段增加；分子學改變主要表現為表皮增生和分化性標志表達異常[4]。成纖維細胞作為真皮中的主體細胞成分，在衰老的過程中發揮了核心作用[5-6]。其主要生物學功能是分泌膠原纖維、彈性纖維及各種基質成分，如硫酸軟骨素及透明質酸等，和各種蛋白質的復合物，如蛋白多糖。這些共同構成了皮膚充盈、承受拉力、保持光滑有彈性的物質基礎[7]。衰老皮膚的成纖維細胞數量逐漸減少、合成膠原蛋白和彈性蛋白的能力下降，且Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的比例變小，膠原纖維變粗，出現異常交鏈。同時分泌基質降解蛋白酶(MMPs)增加，MMPs能特異性降解幾乎所有的細胞外基質成分，使膠原纖維減少、彈性纖維斷裂紊亂，皮膚出現皺紋[8]。

研究表明，TGF-β三種異構體在皮膚表皮層、真皮層以及毛囊和汗腺細胞內都有表達[10]。與TGF-β2，3相比，TGF-β1作為成纖維細胞的主要趨化因子，與創傷修復、皮膚老化的關系顯得尤為密切；TGF-β2隨著毛囊的發育成熟，其在毛囊細胞內表達顯著增強，而TGF-β3則在角質細胞和血管內皮細胞內表達明顯。

TGF-β1對成纖維細胞及其他間葉組織來源的細胞有明顯的刺激作用，主要分布于表層基底細胞及胞外基質中，可以通過增加基質蛋白的合成，如膠原蛋白、糖蛋白的表達和分泌，加強細胞黏附蛋白受體的轉錄、翻譯和處理過程；并可減少MMPs的合成，對細胞的形態發生、增殖和分化過程起著重要作用，有利于胚胎發育和細胞修復、組織修復[9]。本實驗證實，TGF-β1在不同年齡的SD大鼠皮膚組織中表達有顯著差異，在青年組大鼠皮膚中TGF-β1蛋白表達強，而在衰老組大鼠的皮膚組織中呈陰性表達，提示皮膚的生長發育、表型和功能的維持可能存在TGF-β1介導的信號通路參與，并且內源性TGF-β1可能是皮膚修復與再生的重要內源性調控因子。

TGF-β2主要分布于汗腺細胞及毛囊細胞中，能夠誘導胚胎發育過程中中胚層的形成，促進毛囊等皮膚輔助結構的形成[10]，在本實驗中，各年齡組大鼠的皮膚組織中TGF-β2含量極少，年齡差異不明顯，提示TGF-β2在皮膚組織中的含量極微，對皮膚的老化產生的影響可能較TGF-β1、3小。

有研究采用MTT比色法檢測TGF-β3對瘢痕組織成纖維細胞增殖活性的影響，并以3H-脯氨酸摻入法檢測細胞內膠原合成及TGF-β1蛋白表達情況。結果證實，TGF-β3可抑制成纖維細胞的增殖，下調TGF-β1蛋白及Ⅰ型膠原蛋白表達[11]。本實驗中，TGF-β3在不同年齡的SD大鼠皮膚組織中有著相對穩定的表達，年輕組表達少于TGF-β1卻明顯多于TGF-β2，而老年組表達均高于另外兩種蛋白，提示TGF-β3可能在抑制成纖維細胞增殖，下調TGF-β1蛋白及Ⅰ型膠原蛋白表達方面對皮膚的衰老有一定的促進作用。

因此，我們可以認為在三種TGF-β蛋白中，TGF-β1表達的改變可能在皮膚衰老過程中起到主要作用，而TGF-β3通過何種機制對皮膚衰老產生影響還有待進一步的研究證實。

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