張力刺激皮膚成纖維細胞向肌成纖維細胞分化的實驗研究

傅士博 溫從吉 王琛 王丹茹

攣縮性瘢痕嚴重影響患者容貌，導致局部功能障礙，是整形外科最為常見的疾病之一。肌成纖維細胞因高表達收縮性蛋白α-SMA，并可大量分泌細胞外基質，被認為是瘢痕攣縮和增生的主要原因。目前普遍認為，肌成纖維細胞并非獨立細胞類型，而是成纖維細胞受機械張力和炎癥刺激發生適應性改變的過渡階段[1]。

手術治療瘢痕攣縮，往往會造成明顯的供區損傷。隨著整形外科治療技術的不斷發展，越來越多突破性治療理論被提出，部分已經被用于臨床(如脂肪注射等)[2]。然而，在研究領域因缺少持久穩定的動物瘢痕模型限制了新技術的研發[3]。通過構建瘢痕體外模型開展相應研究存在兩個主要不足，①瘢痕細胞質量不可控:這類研究主要依靠體外培養瘢痕組織中分離的成纖維細胞[4]，但是瘢痕增生存在著明顯的個體差異，限制了實驗的可控性及可重復性。②平面培養:體內細胞被細胞外基質完全包埋，所受的力也是三維的，而平面培養無法完全模擬這種力學環境[5]。

為了突破這兩大局限，我們構建了基于三維培養的人真皮成纖維細胞張力刺激模型，體外誘導其向肌成纖維細胞分化。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和儀器

人真皮組織來源于2013年8月至2013年12月間我科手術切除的患者多余皮膚組織(獲患者知情同意)。

Ⅰ型鼠尾膠原、DMEM高糖/低糖培養液、膠原酶、中性蛋白酶(美國BD公司)；FITC-鬼筆環肽(美國Sigma公司)；濱珊瑚(上海市組織工程研究重點實驗室)；硅橡膠板(GY-131，寧海市佳普醫用橡膠制品有限公司)；有機玻璃板(HG/T 2713-1995)；抗人α-SMA單克隆抗體(美國Abcam公司)。

ECLIPSE 90i顯微鏡(日本Nikon公司)，自動CO2培養箱(美國Forma Scientific公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 真皮成纖維細胞分離與培養

將皮膚組織修去皮下組織后，剪成5 mm×1 mm的小條，浸于0.2%中性蛋白酶溶液中4℃低溫過夜。次日撕掉表皮，PBS沖洗后剪碎真皮，0.15%膠原酶溶液37℃震蕩消化2 h，70 μm尼龍網過濾消化液，1 500 r/min離心5 min，DMEM高糖培養基(10%FBS，1%青鏈霉素)重懸，置于100 mm培養皿，37℃、5%CO2條件下培養，80%以上融合后傳代培養[6]。

1.2.2 拉伸實驗

將Ⅰ型鼠尾膠原蛋白(8.05 mg/mL)、HEPES、DMEM高糖培養液(無FBS，1%青鏈霉素)和FBS以3∶3∶1∶1比例低溫(4℃)混合，加入預冷的PBS，調節膠原蛋白濃度至1 mg/mL。每1 mL膠原蛋白液約加入30 μL NaOH溶液(1 M)滴定。將成纖維細胞用上述混合液低溫重懸，調整細胞濃度至1×106cells/mL。趁低溫將細胞懸液倒入事先放置濱珊瑚小塊的模具上，37℃孵育30 min使膠原蛋白凝固[7]。將膠原分為牽拉組和非牽拉組，牽拉組(n=9)安裝錨定裝置，非牽拉組(n=9)不安裝，加入DMEM高糖(10%FBS，1%青鏈霉素)培養液，37℃培養。分別于第1、3、5天收集膠原塊。

含有膠原蛋白的細胞懸液滲入多孔珊瑚塊中并凝固后，纖維絲束纏結在空隙間，錨定裝置固定多孔珊瑚塊，達到對細胞牽拉的目的[8]。

圖1 拉伸實驗Fig.1Tensile test

1.2.3 免疫熒光染色

將膠原塊切下約1 cm×1 cm大小，埋入Tissue Teck OCT冰凍切片包埋劑中，液氮速凍。切成8 μm厚冰凍切片，室溫晾干后PBS沖洗3遍，0.3%Triton溶液打孔，37℃孵育15 min。PBS震蕩洗滌15 min，加入適量的10%山羊血清封閉，37℃孵育30 min，加入適量的抗人α-SMA溶液(1∶1 500)，4℃冰箱過夜(不小于16 h)，PBS常溫洗滌15 min，洗脫抗體，加入Phalloidin-FITC(綠色熒光，5 μg/mL)溶液適量，室溫反應30 min，二抗(1∶500，結合TRITC紅色熒光基團)37℃孵育45 min，PBS室溫震蕩洗滌3遍，不少于10 min，DAPI(1∶500～1∶1 000)溶液染核90 sec，PBS震蕩洗滌3遍，不少于15 min，熒光防淬滅封片劑、蓋玻片封裝，待封片劑凝固后觀察。為長期貯存防止熒光淬滅，玻片以鋁箔包裹，常溫干燥處存放[9]。

1.2.4 細胞生長曲線繪制和Real-time PCR檢測

將膠原塊剪碎后用0.15%膠原酶消化15 min，光鏡下血球計數板計數，將不同時間點凝膠中細胞數量繪制成細胞生長曲線。細胞懸液1 500 r/min離心5 min，TRIzol試劑提取總RNA，反應步驟參照cDNA逆轉錄合成試劑盒(Promega公司)。1 μg總RNA用200 U逆轉錄酶和20 pM的OligodT合成cDNA，使用引物如表1所示。

表1 引物序列Table 1Primer sequences

1.2.5 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件對本實驗結果進行統計學分析，由于本實驗樣本總量較小，采用配對t檢驗，P0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 張力環境下三維培養體系的鏡下形態

細胞經過三維力學拉伸，其形態較單純三維培養細胞顯著極化，且極化方向與牽拉方向一致(圖2)，細胞質顆粒明顯增多，間接地提示了代謝活躍。

圖2 三維培養24 h的成纖維細胞形態Fig.1Histological observation of fibroblasts after 3D cultured for 24 hours

2.2 免疫熒光染色

通過對細胞雙標染色，發現細胞形態明顯由不規則形變為規則的雙極化梭形，并且牽拉后的成纖維細胞α-SMA和fibronectin染色亮度(細胞熒光強度-背景雜光)明顯高于無張力細胞(圖3)。

2.3 凝膠細胞生長曲線(補充實驗方法)

臺盼藍染色，細胞計數，繪制細胞生長曲線。結果顯示，三維培養環境下細胞增殖緩慢，機械牽拉有促進細胞增殖的趨勢，但差異不顯著(P＞0.05)(圖4)。

圖3 三維培養成纖維細胞的免疫熒光染色(400×)Fig.3Immunofluorescent staining of 3D cultured fibroblasts(400×)

圖4 細胞生長曲線的比較Fig.4The comparison of cell growth curve between stretch group and non-stretch group

2.4 Real-time PCR

檢測張力誘導模型凝膠第1、3、5天標本的α-SMA、Fibronectin和Ⅰ、Ⅲ型膠原基因轉錄水平。結果顯示，第3、5天，實驗組α-SMA、纖連蛋白和Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達明顯高于對照組(P0.05)(n＝3，圖5)，而第1天兩組mRNA表達均無明顯差異(P0.05)。說明機械牽拉可促進成纖維細胞α-SMA、纖連蛋白和Ⅰ、Ⅲ型膠原基因的轉錄，單純應用機械牽拉能夠促進其向肌成纖維細胞分化，且該趨勢隨干預時間的延長而愈加明顯。

圖5 人α-SMA、纖連蛋白和Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA半定量對比Fig.5Comparison of relative quantification of mRNA in human α-SMA,fibronectin,typeⅠandⅢcollagen

3 討論

攣縮性瘢痕是整形外科最為常見的疾病之一，手術治療往往引起嚴重的供區損傷，術后效果難以滿足美觀需求。

以往的相關研究不能模擬細胞在體內的三維力學環境，而且所采用的瘢痕組織來源的成纖維細胞質量可控性差，使得實驗結果無法重復。本研究中，細胞來源為正常皮膚成纖維細胞，通過三維培養和機械牽拉，促使其向肌成纖維細胞分化，突出了研究模型的穩定性和可控性，并且更加符合細胞在體內的力學環境。

本實驗發現，三維培養的成纖維細胞增殖極為緩慢，機械牽拉對細胞增殖的影響不顯著。細胞-細胞外基質接觸是細胞增殖緩慢的關鍵因素[10]，本模型相比平面培養[11]和彈力膜平面培養[5]更加接近瘢痕或皮膚的組織結構，類似正常組織細胞增殖緩慢。同時，Real-time PCR檢測結果顯示牽拉組α-SMA、Fibronectin和Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達高于非牽拉組，說明細胞開始向肌成纖維細胞分化，這也符合瘢痕攣縮和增生常發生于體表高張力區域的現象[12]。

綜上所述，我們認為這種基于成纖維細胞三維培養，通過機械張力誘導皮膚成纖維細胞向肌成纖維細胞分化的模型，穩定性優于既有的瘢痕體外模型，并且細胞-細胞外基質接觸更接近細胞在體內的環境。另外，本實驗采用了矩形膠原塊，牽拉方向單一，相比圓形膠原塊更易通過細胞極化方向和程度判斷細胞對機械刺激的反應[13]。

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