正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化多頻超聲波輔助法提取綠茶茶多酚工藝

楊雅瑜，劉玉德，張 媛，石學(xué)智

（北京工商大學(xué)，材料與機(jī)械工程學(xué)院，北京 100048）

茶多酚（Tea Polyphenols）是茶葉中多酚類(lèi)物質(zhì)的總稱(chēng)，包括黃烷醇類(lèi)、花色苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、黃酮醇類(lèi)和酚酸類(lèi)等。其中以黃烷醇類(lèi)物質(zhì)（兒茶素）最為重要，含量約占茶多酚總量的70%左右。茶多酚又稱(chēng)茶鞣或茶單寧，是形成茶葉色香味的主要成份之一，也是茶葉中有保健功能的主要成份之一［1－3］。研究表明，茶多酚等活性物質(zhì)具有解毒和抗輻射作用，能有效地阻止放射性物質(zhì)侵入骨髓，并可使鍶90和鈷60迅速排出體外，被健康及醫(yī)學(xué)界譽(yù)為“輻射克星”［4－6］。我國(guó)對(duì)茶多酚的研究始于上世紀(jì)五六十年代，到七十年代初已開(kāi)始專(zhuān)項(xiàng)研究，目前已處于世界領(lǐng)先水平［7－9］。現(xiàn)今茶多酚的功能引起了各國(guó)的廣泛重視，成為各工業(yè)化國(guó)家的技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)目標(biāo)和研究開(kāi)發(fā)熱點(diǎn)［10－11］。然而，目前應(yīng)用較多的還是有機(jī)溶劑萃取法和金屬離子沉淀法，所得產(chǎn)品具有潛在的毒害。并且，大多數(shù)茶多酚提取工藝的提取率較低。因此，需大力開(kāi)發(fā)和推廣無(wú)毒、無(wú)污染、高效的茶多酚提取新工藝，并對(duì)提取工藝做出進(jìn)一步改進(jìn)和創(chuàng)新，提高茶多酚提取率。而超聲輔助提取技術(shù)作為一種新的提取分離技術(shù)對(duì)提高茶多酚提取率，降低物耗、能耗等均有顯著的作用和優(yōu)勢(shì)，有著廣闊的應(yīng)用前景［12－14］。通過(guò)目前的研究成果可知，由于超聲波具有的機(jī)械粉碎和空化效應(yīng)等作用，增大了物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，從而使多頻超聲輔助提取茶多酚工藝可以有效提高提取率。本文將多頻超聲輔助法和傳統(tǒng)浸提法兩種提取方法進(jìn)行比較研究，用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化多頻超聲輔助法提取茶多酚的工藝，得到最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

陳年綠茶 市售;去離子水 北京工商大學(xué)自制;硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等 均為分析純。

循環(huán)超聲提取設(shè)備 DFXHTQ－900，南京新辰生物科技有限公司;高速萬(wàn)能粉碎機(jī) FW－100，北京中興偉業(yè)儀器有限公司;電子天平 FA2004，上海越平科學(xué)儀器有限公司;循環(huán)水式真空泵:SHZ－D（Ⅲ） 河南省予華儀器有限公司;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) UVmini－1240，北京東方安諾生化科技有限公司。

1.2 試劑及茶多酚含量測(cè)定方法

1.2.1 酒石酸亞鐵溶液 稱(chēng)取1.0g硫酸亞鐵（FeSO4·7H20）和 5.0g酒石酸鉀鈉（C14H4O6KNa·4H2O），用水溶解并定容至1L（低溫保存有效期10d）。

1.2.2 pH7.5磷酸鹽緩沖 0.67mol/L磷酸二氫鉀:稱(chēng)取經(jīng)110℃烘干2h的磷酸二氫鉀（KH2PO4）9.08g，加水溶解后定容至1L。

取上述0.67mol/L的磷酸氫二鈉溶液85mL和0.67mol/L的磷酸二氫鉀溶液15mL混合均勻。

1.2.3 取樣 按GB/T8302的規(guī)定［15］。

1.2.4 試樣制備 按 GB/T8303的規(guī)定［16］。樣品預(yù)處理，將茶葉用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎后過(guò)篩（60目），存放于干燥避光備用。

1.2.5 試液制備 傳統(tǒng)浸取法將樣品茶葉末至于容器中，加入去離子水中，混勻，以提取溫度、提取時(shí)間與料液比為設(shè)定條件進(jìn)行傳統(tǒng)浸提;多頻超聲輔助法將樣品放入循環(huán)超聲提取設(shè)備，以提取溫度、提取時(shí)間、料液比、超聲功率與循環(huán)速度為設(shè)定條件，進(jìn)行多頻超聲波提取。將浸提液和提取液冷卻至室溫，取上清液置于100mL燒杯中。

隨著全球經(jīng)濟(jì)的一體化，在高科技發(fā)展迅猛的今天，我國(guó)各個(gè)行業(yè)已經(jīng)進(jìn)入了信息網(wǎng)絡(luò)化、自動(dòng)化的時(shí)代，各個(gè)行業(yè)各個(gè)領(lǐng)域都已經(jīng)離不開(kāi)信息技術(shù)，并在其中發(fā)揮了非常重要及關(guān)鍵的作用。通過(guò)現(xiàn)代化的信息技術(shù)可以更好的歸類(lèi)管理與儲(chǔ)存檔案信息，可以有效的避免了傳統(tǒng)檔案管理所存在的缺陷與不足。所以我們政府檔案管理人員也應(yīng)該積極的運(yùn)用現(xiàn)代信息技術(shù)，把人才的優(yōu)勢(shì)充分發(fā)揮出來(lái)，建設(shè)一個(gè)能夠滿足本地發(fā)展的檔案管理體系，這樣不僅使檔案的安全性得到提高，同時(shí)還能夠使資料整合性得到有效提高。

1.2.6 茶多酚提取率的測(cè)定方法 按照GB/T8313－2002《茶 茶多酚測(cè)定》中的方法快速測(cè)定提取率［17］。

結(jié)果計(jì)算方法和公式:

茶多酚提取率，以干態(tài)質(zhì)量百分率表示，按下式計(jì)算:

式中:L1－試樣的總量，mL;L2－測(cè)定時(shí)的用液量，mL;M0－試樣的質(zhì)量，g;m－試樣干物質(zhì)含量百分率，%;A－試樣的吸光度;1.957－用10mm比色杯。

當(dāng)吸光度等于0.50時(shí)，每毫升茶湯中含茶多酚當(dāng)1.957mg。如果符合重復(fù)性的要求（即同一樣品的兩次測(cè)定值之差，每100g試樣不得超過(guò)0.5g），則取兩次測(cè)定的算術(shù)平均值作為結(jié)果。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 料液比對(duì)茶多酚提取率的影響 傳統(tǒng)浸提法:配制不同料液比的試液，在60℃水溫下，浸提30min;多頻超聲波提取法:設(shè)定四種不同頻率的超聲波同時(shí)工作（28kHz，200W）、（33kHz，200W）、（40kHz，200W）、（60kHz，200W），配制不同料液比的試液，設(shè)置溫度為60℃，循環(huán)速度為700r/min，提取30min。計(jì)算兩種方法不同料液比的提取率。

1.3.2 提取時(shí)間對(duì)茶多酚提取率的影響 傳統(tǒng)浸提法:配制料液比為1∶80g/mL的試液;多頻超聲波提取法:設(shè)定四種不同頻率的超聲波同時(shí)工作（28kHz，200W）、（33kHz，200W）、（40kHz，200W）、（60kHz，200W），配制料液比為1∶70g/mL的試液，設(shè)置循環(huán)速度700r/min，水溫60℃。用兩種方法分別提取10、20、30、40、50、60、70、80min，并計(jì)算相應(yīng)的提取率。

1.3.3 溫度對(duì)茶多酚提取率的影響 傳統(tǒng)浸提法:配制料液比1∶80g/mL，設(shè)定時(shí)間為70min;多頻超聲提取法:設(shè)置四種超聲波（28kHz，200W、33kHz，200W、40kHz，200W、60kHz，200W）同時(shí)工作，配制料液比1∶70g/mL，設(shè)定時(shí)間為20min。用兩種方法分別在 40、50、60、70、80、90℃水溫下提取，并計(jì)算相應(yīng)提取率。

1.3.5 循環(huán)速度對(duì)茶多酚提取率的影響 設(shè)置四種超聲波（28kHz，200W）、（33kHz，200W）、（40kHz，200W）、（60kHz，200W）同時(shí)工作，配制料液比1∶70g/mL，設(shè)定時(shí)間為20min，溫度為60℃，循環(huán)速度分別為 300、700、1000、1200、1500、2000r/min，并計(jì)算相應(yīng)的提取率。

1.3.6 多頻超聲輔助提取茶多酚優(yōu)化工藝研究［18－20］以單因素實(shí)驗(yàn)得到的影響因素作為參考，再用正交實(shí)驗(yàn)多頻超聲輔助提取茶多酚優(yōu)化工藝進(jìn)行研究。選擇提取時(shí)間、提取溫度、料液比、超聲波功率、超聲波頻率水平因素，如表1所示，根據(jù)混合正交表L16（45）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)并分析。

1.3.7 實(shí)驗(yàn)方法分析 實(shí)驗(yàn)方法有單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)。采用單因素實(shí)驗(yàn)方案，分別研究浸提時(shí)間、浸提溫度、料液比、循環(huán)速度與超聲功率等因素對(duì)茶多酚提取分離效果的影響，找出每個(gè)因素的具體影響規(guī)律，并確定影響茶多酚浸提率的重要因素的最優(yōu)水平變化范圍。采用正交實(shí)驗(yàn)來(lái)確定多頻超聲提取茶多酚的最佳提取工藝條件［21－25］。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2.1.1 料液比對(duì)茶多酚提取率的影響 結(jié)果如圖1所示:

圖1 料液比對(duì)茶多酚提取率的影響Fig.1 The effect of material liquid ratio on the extraction rate of tea polyphenols

料液比取值范圍為1∶20至1∶90g/mL。由圖1可知，隨著液體比例的增大，茶多酚提取率先增加后減少。這是因?yàn)椴瓒喾拥娜艹隽侩S著液體比例的增加而增大，但是，液體比例增加到一定程度后，茶多酚溶出量增長(zhǎng)變得緩慢，提取率反而下降。傳統(tǒng)浸提料液比為1∶80g/mL時(shí)，提取率最大，為15.93%;超聲提取料液比為 1∶70g/mL時(shí)，提取率最大，為24.10%。由此可看出，多頻超聲提取與傳統(tǒng)溶劑提取相比，可以減少溶劑的使用量，節(jié)約溶劑，并且提取率較高。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)茶多酚提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 時(shí)間對(duì)茶多酚提取率的影響Fig.2 The effect of the extraction time on the extraction rate of tea polyphenols

提取時(shí)間的取值范圍為10～80min。由圖2可知，隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多頻超聲輔助提取茶多酚的提取率先增大后降低，超聲提取20min時(shí)提取率便達(dá)到最大24.50%;傳統(tǒng)浸提70min時(shí)，提取率最大17.85%。由此可看出，多頻超聲提取明顯縮短了提取時(shí)間，這是由于超聲波所具有的機(jī)械粉碎和空化效應(yīng)等作用，增大了物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加了溶劑的穿透力，提高茶多酚溶出速度和溶出數(shù)量，從而大大縮短了茶多酚的提取時(shí)間［26－27］。

2.1.3 溫度對(duì)茶多酚提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度對(duì)茶多酚提取率的影響Fig.3 The effect of the extraction temperature on the extraction rate of tea polyphenols

溫度的取值范圍為35～95℃。由圖3可知，在選定范圍內(nèi)，適當(dāng)提高溫度對(duì)茶多酚提取是有利的，提取溫度的升高可以加快茶多酚的溶解。傳統(tǒng)浸提法在70℃水溫下提取率最大17.88%。超聲提取在60℃時(shí)提取率最大24.63%。但過(guò)高的溫度會(huì)加速茶多酚氧化，提取率反而有所下降。這是因?yàn)椴瓒喾邮且环N多羥基酚類(lèi)物質(zhì)，熱穩(wěn)定性不好，高溫下加熱時(shí)間一長(zhǎng)易被氧化，導(dǎo)致一部分茶多酚丟失，另外，隨著溫度的繼續(xù)升高，超聲波的空化效應(yīng)減弱，提取能力降低。

綜合以上各個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)可得:傳統(tǒng)浸提的適宜條件是:料液比1∶80g/mL，時(shí)間70min，溫度80℃，提取率最大為17.88%。

2.1.4 超聲波功率對(duì)茶多酚提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 功率對(duì)茶多酚提取率的影響Fig.4 The effect of multi－frequency ultrasonic power on the extraction rate of tea polyphenols

超聲波功率取值范圍為100～1000W。由圖4可知，超聲波功率較小時(shí)，隨著超聲波功率的增大，茶多酚提取率也隨之增大，200W時(shí)提取率最大24.63%，之后繼續(xù)增大超聲功率，提取率逐漸下降。這主要是因?yàn)槌暪β试龃螅曌饔迷鰪?qiáng)，使空化泡的運(yùn)動(dòng)比較劇烈;但是隨著超聲功率進(jìn)一步增大，加速了提取液的流動(dòng)，從而物料停留在超聲場(chǎng)中的時(shí)間減少，破壁作用隨之減弱，茶多酚溶出速率減小，再加上功率越大，產(chǎn)生的熱效應(yīng)越強(qiáng)可能破壞茶多酚的結(jié)構(gòu)，使得有效的茶多酚含量減少。

2.1.5 循環(huán)速度對(duì)茶多酚提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。

循環(huán)速度取值范圍為300～2100r/min。由圖5的結(jié)果可以看出，隨著循環(huán)速度的提高，茶多酚的提取率總體趨勢(shì)隨著轉(zhuǎn)速的增加先升高后降低;1200r/min時(shí)，提取率最大為25.49%，其原因主要是由于電機(jī)的攪拌有利于茶葉顆粒的擴(kuò)散，加速了茶多酚的溶出，從而提高茶多酚的提取率;而當(dāng)轉(zhuǎn)速過(guò)大時(shí)，易產(chǎn)生渦流，抑制了空化效應(yīng)的產(chǎn)生，同時(shí)由于渦流卷入大量的空氣，加劇茶多酚被溶劑中的溶解氧氧化，從而降低超聲的提取效果，提取率反而下降。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Repeatability on Multi－frequency Ultrasound－assisted Extraction of Tea Polyphenols from Green Tea

圖5 循環(huán)速度對(duì)茶多酚提取率的影響Fig.5 The effect of cycle speed on the extraction rate of tea polyphenols

2.2 多頻超聲輔助提取茶多酚優(yōu)化工藝研究

結(jié)果如表2所示。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 2 The multi－frequency ultrasonic－assisted extracting the result of orthogonal text

由表2可知，經(jīng)過(guò)均值和極差分析與比較，在選定范圍內(nèi)，各因素對(duì)茶多酚提取率的影響順序?yàn)?D＞E＞A＞B＞C（功率＞頻率＞時(shí)間＞溫度＞料液比）;最佳提取工藝條件為:超聲提取（28kHz，200W），（33kHz，200W），（40kHz，200W），（60kHz，200W），提取時(shí)間20min，提取溫度65℃，料液比1∶70g/mL，循環(huán)速度1200r/min。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過(guò)實(shí)驗(yàn)和分析，得出在最佳提取工藝條件下，多頻超聲波輔助法提取茶多酚的提取率和數(shù)據(jù)分析，見(jiàn)表3。

由表3可知，經(jīng)過(guò)5次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，所得到的提取率平均值為25.69%，標(biāo)準(zhǔn)方差為0.35%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.23%，結(jié)果表明在最佳工藝條件下，多頻超聲輔助提取茶多酚的重復(fù)性好。

3 結(jié)論

在規(guī)定條件下，采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)多頻超聲輔助法提取茶多酚工藝的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:隨著料液比的降低，茶多酚提取率先增加后減少，超聲提取料液比為1∶70g/mL時(shí)，提取率最大;隨著超聲提取時(shí)間的增大，多頻超聲輔助法提取茶多酚的提取率先增大后降低，超聲提取20min時(shí)提取率便達(dá)到最大24.50%;在一定范圍內(nèi)，提取溫度的升高可以加快茶多酚的溶解，但過(guò)高的溫度會(huì)加速茶多酚氧化，提取率反而有所下降，在60℃時(shí)提取率最大;超聲功率較小時(shí)，隨著超聲波功率的增大，茶多酚得率也隨之增大，200W時(shí)提取率最大24.63%，之后繼續(xù)增大超聲功率，提取率逐漸下降;隨著循環(huán)速度的提高，茶多酚的提取率總體趨勢(shì)隨著轉(zhuǎn)速的增加先升高后降低，1200r/min時(shí)，提取率最大。

利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化多頻超聲輔助法提取茶多酚工藝的實(shí)驗(yàn)方案表明，各因素對(duì)茶多酚提取率的影響順序?yàn)?D＞E＞A＞B＞C（功率＞頻率＞時(shí)間＞溫度＞料液比）。多頻循環(huán)超聲輔助法提取比傳統(tǒng)浸提提取率高，在最佳工藝條件下的茶多酚提取率分別為25.69%、17.88%。與傳統(tǒng)的提取方法相比，多頻循環(huán)超聲輔助法提取的提取率提高了43.68%。多頻超聲輔助提取法提取茶多酚極大地提高了超聲場(chǎng)的利用效率，保證了物料的均勻破碎，減少了局部過(guò)度破碎現(xiàn)象，充分發(fā)揮了超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)以及熱效應(yīng)在茶多酚提取方面的作用，即可促進(jìn)細(xì)胞破碎、加快傳質(zhì)、加速反應(yīng)，也可避免茶多酚在高溫下長(zhǎng)時(shí)間氧化，保證了茶多酚的提取質(zhì)量并提高了效率［28－29］。

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