米曲霉發酵米糠制取米糠多肽及其抗氧化活性研究

魏 明，薛正蓮，趙世光，錢森和

（安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽蕪湖 241000）

米糠是大米加工的副產品，我國米糠年產量超過一千萬噸，但米糠有效利用率尚不足20%。米糠中蛋白質含量為12%～18%，是大米的一倍［1］。多肽是蛋白質水解的產物，具有抗氧化、降血壓、降低膽固醇含量以及促進鈣吸收等功能［2－5］。米糠蛋白是一種優質蛋白，其水解的多肽具有重要生理功能。研究表明，大米蛋白的堿性蛋白酶水解產物能抑制血管緊張素轉化酶（AEC）的活性［6］。有學者從米糠蛋白的蛋白酶水解產物中分離出了類阿片拮抗肽［7］。

目前，米糠多肽主要通過酶法水解米糠蛋白獲得，且不同的酶水解所獲得的活性肽不同［8］。采用微生物發酵生產米糠多肽的研究報道較少。微生物在培養過程中可以產生各種蛋白酶，使蛋白質降解，提高多肽的產率，并且獲得功能更多的小肽［9－10］。另外，利用微生物發酵生產米糠多肽可以降低生產成本，適于工業化生產。本研究通過微生物發酵生產米糠多肽，并分析多肽分子量分布規律及其活性，為米糠蛋白的深度開發和利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米糠來源南陵大米加工廠。

葡聚糖凝膠G－25 Pharmacia公司;輔酶Ⅰ、谷胱甘肽、Gly－Gly－Tyr－Arg四肽 Sigma公司;三氯乙酸、DPPH、H2O2、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、氫氧化鈉、硫酸銅、水楊酸、乙醇，酪氨酸 國藥集團試劑公司，為分析純。

菌種與培養基:米曲霉（Aspergillus oryzae，AS3.951）中國科學院微生物保藏中心，種子培養基（PDF）:馬鈴薯汁1000mL，葡萄糖20g，自然pH。發酵培養基:米糠溶液添加KH2PO4和MgSO4121℃滅菌20min。

754紫外可見分光光度計，YX5－A臺式離心機 上海儀器有限公司;HZ－9310KB恒溫搖床，HH－4恒溫水浴鍋 江蘇杰瑞爾電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 米糠預處理 米糠→脫脂→干燥→粉碎過20目篩備用。

1.2.2 種子液的制備和米糠發酵 將菌種在PDF斜面培養基上活化，然后從斜面挑取孢子接種至PDF液體培養基中，于28℃下培養72h后備用。以米糠為基本培養基，250mL三角瓶，每瓶裝液量為100mL，米糠添加量為5g，按體積分數接種米曲霉種子液，120r/min搖床培養。將發酵液于5000r/min離心10min，上清液經0.45μm微孔濾膜過濾，濾液分成兩份，一份測定多肽含量，另一份測定發酵液的蛋白酶活力。

1.2.3 米曲霉發酵米糠單因素實驗 固定接種量5%、pH6、培養溫度28℃和培養時間48h，在其他條件不變的情況下，以蛋白酶活力和多肽含量為指標，選取培養時間為72h，在不同時間段測定蛋白酶活力和多肽含量，接種量為1%、5%、10%、15%、20%、25%，培養溫度為 20、25、30、35、40、45℃，起始 pH 為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 進行單因素實驗，每組實驗進行3次平行。

1.2.4 米曲霉發酵米糠工藝優化實驗 根據Box－Benhnken的中心組合實驗設計原理，綜合單因素實驗結果，選取發酵時間、發酵溫度、接種量影響顯著的3個因素，在單因素實驗基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法，因素與水平見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Encode table of factor and levels

1.2.5 蛋白酶活力和多肽的測定 蛋白酶活用Folin法測定［11］，酶活力定義為:每mL發酵液每分鐘催化產生1μg酪氨酸所需的酶量為 1個酶活單位U（μg/mL·min）。

多肽含量測定用三氯乙酸法［12］，配制 Gly－Gly－Tyr－Arg四肽標準溶液，以肽的濃度為橫坐標X（mg/mL），OD值為縱坐標Y，制作標準曲線，得到回歸方程y=0.0368x+0.003，R2=0.9993。將等體積的三氯乙酸（10%）加入到發酵液中，靜置10min，然后在5000r/min下離心15min，在上清液中加入一定量的雙縮脲試劑（樣液∶雙縮脲試劑 =3∶2，V/V），于漩渦混合儀上混合均勻，靜置10min，2000r/min離心10min，取上清液于540nm下測定OD值，對照標準曲線求得樣品溶液中的多肽量。米糠多肽含量（mg/g）=發酵液中多肽量/米糠質量。

1.2.6 米糠多肽的分子量測定 米糠多肽分子量測定參照文獻［13］略作改動。米糠發酵上清液經超濾膜過濾后（截留分子量大于2000u），取1mL濾液上柱（SephadexG－25），以蒸餾水為洗脫液，洗脫速度為40mL/h，用自動部分收集器收集洗脫液，每管收集3mL，在 238nm處檢測流出液。以輔酶Ⅰ（MW 663.45），Gly－Gly－Tyr－Arg（MW 451.48），谷胱甘肽（MW 307.32）為參照物，標準分子量的常用對數與管數之間的關系曲線為:n=374.2－122.6logMW。

1.3 數據處理

原始數據采用 origin8.5完成，實驗數據采用PPS7.01軟件進行統計分析;采用Design Expert 7.1.6軟件對中心組合設計實驗數據進行回歸分析。每組實驗做三次平行實驗，圖中的數據為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 發酵時間對米曲霉產蛋白酶和多肽含量的影響

從圖1可以看出，在發酵16h之前，蛋白酶活力很低，40～48h時，酶活力趨于穩定，平均酶活力為92.6U，48h后，酶活力逐漸下降。在16h之前，多肽含量很低，48h達到最大，之后多肽含量增加緩慢。米曲霉接種到培養基中要經過延遲期、對數生長期、穩定期和衰退期等階段。在延遲期米曲霉生長緩慢，產酶量很低，達到40h后，米曲霉進入穩定期，產酶能力最佳，衰退期產酶量降低。多肽含量與蛋白酶密切相關，在延遲期蛋白酶產量很低，多肽含量也很低，隨著產酶量的增加，多肽含量也增加，在發酵后期，多肽含量降低，可能培養時間過長，多肽被微生物消耗，因此發酵最佳時間為48h，此時多肽含量為112.2mg/g。

2.2 接種量對米曲霉產蛋白酶和多肽含量的影響

圖1 培養時間對米曲霉產蛋白酶和多肽含量的影響Fig.1 Effect of culture time on protease activity and peptide content in rice bran during fermentation

從圖2可以看出，隨著接種量的增加，蛋白酶活力和多肽含量均增加，當接種量為15%時，蛋白酶活力和多肽含量達到最大，分別為96.5U和121.6mg/g，繼續增加接種量蛋白酶活力和多肽含量有所下降，這是由于接種量過高，發酵前期菌體生長過快，導致發酵后期營養不足而使菌體自溶，使多肽含量降低，因此接種量15%較為適宜。

圖2 接種量對米曲霉產蛋白酶和多肽含量的影響Fig.2 Effect of inoculum size on protease activity and peptide content in rice bran during fermentation

2.3 培養溫度對米曲霉產蛋白酶和多肽含量的影響

從圖3中可以看出，隨著溫度的升高，蛋白酶活性升高，多肽含量也提高。當溫度達到30℃時，多肽含量達到122.8mg/g;繼續升高溫度，蛋白酶活力降低，多肽含量也降低，所以培養溫度30℃為宜。

圖3 溫度對米曲霉產蛋白酶和多肽含量的影響Fig.3 Effect of temperature on protease activity and peptide content in rice bran during fermentation

2.4 起始pH對米曲霉產蛋白酶和多肽含量的影響

由圖4可知，隨著pH的升高，蛋白酶活性增加，多肽含量也有所提高。當pH為5.5時，多肽含量最高為121.4mg/g，繼續提高pH，多肽含量降低，可能pH升高降低蛋白酶活性，從而影響多肽的產生。

圖4 pH對米曲霉產蛋白酶和多肽含量的影響Fig.4 Effect of pH on protease activity and peptide content in rice bran during fermentation

2.5 響應面優化實驗

2.5.1 響應面實驗設計及結果 選用中心組合模型，做3因素3水平共15個實驗點的響應面分析實驗。15個實驗點分為兩類:1～12個是析因點;13～15個是零點，為區域的中心點，零點實驗重復3次，用以估計實驗誤差。米糠多肽含量為響應值，實驗結果見表2。

根據表2的實驗結果，采用Design Expert 7.1.6軟件對實驗數據進行回歸分析，求出影響因素的一次效應、二次效應及其交互效應的關聯方程，對米糠多肽的影響因素進行更深入的研究和條件優化，并做出響應面圖。多元回歸擬合分析得到米糠多肽含量與各因素變量的二次方程模型為:米糠多肽含量Y=130.2+7.743X1－ 2.152X2+2.113X3－ 1.385X1X2－2.672X1X3－1.914X2X3－2.155X12－1.175X22－2.161X32從方差分析表3可以看出，用上述回歸方程描述各因素與響應面之間的關系，其因變量和全體自變量之間的線性關系顯著，其中發酵時間和溫度顯著，接種量不是很顯著。從回歸方程各項的方差分析結果還可以看出，可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析和預測。

表2 響應面分析試驗設計及結果Table 2 Response surface design and results

表3 方差分析表Table 3 The analysis of variance table

2.5.2 響應面曲面分析 圖5直觀地反映了各因素對響應值的影響，比較圖5中的3個圖可知:發酵溫度X1、發酵時間X3對米糠多肽得率的影響顯著，表現為曲線相對較陡;而接種量X2表現為曲線較為平滑，響應值變化較小。發酵時間和溫度以及發酵時間和接種量之間有交互作用，其中發酵時間和接種量之間的交互作用顯著（p＜0.05）。

根據所得的模型，可預測在穩定狀態下的最優工藝條件為:發酵時間為48.6h，發酵溫度為29.5℃，接種量為14.6%，米糠多肽含量理論可達到129.5mg/g。進行3次平行實驗驗證，米糠多肽平均含量為128.4mg/g，與理論預測值接近，說明優化結果可靠。

2.6 米糠發酵多肽的分子量分布

采用超濾和SephadexG－25進行層析分離發酵液，分子量參照物與發酵液層析結果如圖6所示。根據標準曲線，由出峰管數推測出分子量分布范圍，并采用面積歸一法對不同分子量肽的含量進行定量分析，結果見表4。由圖6B和表4可知，米曲霉發酵米糠過程中，在發酵液中存在大小不等的多肽，分子量主要集中在500～800u之間，含量為75.6%，其中峰Ⅰ的平均分子量為1221u，峰Ⅱ的平均分子量為682u，峰Ⅲ的平均分子量為638u，峰Ⅳ的平均分子量為578u。

表4 米糠發酵液中多肽分子量分布Table 4 Distribution of peptides from rice bran

2.7 羥基自由基清除能力

圖5 兩因素交互作用對多肽含量影響的響應面圖Fig.5 Surface layer of the mutual－affection of two factors on peptides

圖6 米糠發酵多肽層析圖譜Fig.6 Chromatogram of peptides from rice bran

羥基自由基清除能力如圖7所示。分離的四種米糠多肽均具有清除羥基自由基的能力。隨著多肽濃度的增加，樣品對羥基自由基的清除率也隨之增加，當多肽濃度達到2.5mg/mL時，峰Ⅱ所獲得的多肽對羥基自由基的清除率達到86.2%，但低于對照VC的清除率。

圖7 米糠多肽羥基自由基清除能力Fig.7 The scavenging effects of peptides from rice bran on·OH

2.8 DPPH自由基清除能力

米糠多肽的DPPH清除能力如圖8所示。從圖8可以看出，分離的四種米糠多肽均具有一定的DPPH清除能力，其中峰Ⅳ所獲得的多肽效果最好，隨著多肽濃度的增加，樣品對DPPH自由基清除率也隨之增加，當多肽濃度為2.5mg/mL時，峰Ⅳ所獲得的多肽對DPPH的清除率達到69.8%，但低于對照VC的清除率。

圖8 米糠多肽DPPH自由基的清除能力Fig.8 The scavenging effects of peptides from rice bran on DPPH·

3 結論

利用米曲霉發酵米糠生產多肽，通過響應面優化，發酵米糠生產多肽的最佳條件為:米曲霉的接種量為14.6%，發酵時間為48.6h，發酵溫度為29.5℃，發酵起始pH為5.5，多肽含量可達128.4mg/g。米曲霉發酵米糠產生多肽分子量主要分布在500～800u之間，含量在75.6%，對羥基自由基和DPPH自由基均具有一定清除能力。

［1］姚惠源，周素梅，王立，等.米糠與米糠蛋白質的開發與利用［J］.無錫輕工業大學學報，2002，21（3）:312－316.

［2］劉海軍，樂超銀，邵偉，等.生物活性肽研究進展［J］.中國釀造，2010，29（5）:5－8.

［3］朱銀玲，劉華忠，李思東，等.酶解法制備方格星蟲多肽及其抗氧化作用研究［J］.化學研究與應用，2012，24（9）:1397－1401.

［4］張淑蓉，武瑜，梁葉星，等.南瓜籽仁蛋白多肽的酶法制備和抗氧化活性研究［J］.食品工業科技，2012，33（3）:241－244.

［5］劉樹興，喬曉林.木瓜蛋白酶酶解谷朊粉制備抗氧化多肽的研究［J］.食品工業科技，2013，34（21）:167－173.

［6］Li CH，Liu H，Shi YH，et al.Direct spectrophotometric measurement of angiotensin I－converting enzyme inhibitory activity forscreening bioactive peptides［J］.Journalof Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2005，37（2）:219－224.

［7］陳季旺，陶冠軍，姚惠源.米糠蛋白類阿片拮抗肽的分離純化［J］.食品科學，2004，25（12）:47－50.

［8］劉友明，趙思明，熊善柏，等.米糠的蛋白酶水解提取物抗氧化活性及分子量分布研究［J］.中國糧油學報，2006，21（2）:1－4.

［9］劉姝，余勃.發酵法制備魚鰾多肽及其抗氧化活性研究［J］.食品科學，2009，30（21）:332－334.

［10］吳海濱，劉尊英，曾名湧，等.米曲霉發酵鱈魚皮制取低分子肽條件的優化及活性研究［J］.食品與發酵工業，2011，37（5）:110－114.

［11］房耀維，劉姝，徐煒楓，等.一株有機溶劑穩定性蛋白酶產生菌的篩選與鑒定［J］.食品科學，2009，30（7）:197－201.

［12］魯偉，任國譜，宋俊梅.蛋白水解液中多肽含量的測定方法［J］.食品科學，2005，26（7）:169－171.

［13］云霞，朱蓓薇，吳海濤，等.玉米黃粉蛋白酶解過程的研究及產物分析［J］.食品科學，2003，24（5）:75－78.

［14］Smirnoff N，Cumbes QL.Hydroxygyl radical scavenging activity of compatible solutes［J］.Phytochemistry，1989，28（4）:1057－1060.

［15］Blois MS.Antioxidant determinations by the use of a stable free radical［J］.Nature，1958，118（4）:1199－1200.