中華鱉嗜水氣單胞菌微球緩釋疫苗的研制及免疫效果

劉亞東，李彬，高利偉，管越強

（河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002）

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）是一種人畜共患的病原菌［1］.自中華鱉Pelodiscus sinensis病灶部位分離出來的致病性Ah能引起多種疾病，如紅脖子、紅底板、出血性敗血癥、癤瘡穿孔病和腐皮病等，是最常見且危害最嚴重的一種中華鱉病原菌，也是制約養殖業發展的主要原因之一［2－6］.在中華鱉Ah病防治過程中，最有效的途徑之一是疫苗免疫.研究結果顯示，對中華鱉進行Ah滅活疫苗注射免疫后，再用同源菌攻毒，保護率為80%［7］.利用提純的致病性Ah外毒素滅活后免疫大白兔，制備免疫血清免疫中華鱉，攻毒后免疫保護率大于75%［8］.采用Ah和溫和氣單胞菌Aeromonas sobria 制成化學成分疫苗，注射免疫的中華鱉攻毒后保護率達到了87.5%［9］.

注射法是中華鱉等水產動物免疫防治中最常用的一種方式，但實際操作中工作量較大，往往對養殖動物造成應激反應，且不適于幼齡階段，而其他免疫方法如口服滅活疫苗或浸浴的免疫效果又不盡人意.一些具有良好的生物相容性和生物可降解性的高分子聚合物材料［10］，作為載體包裹疫苗制成緩釋微球疫苗進行口服免疫是提高免疫效果的途徑之一，該方法已開始用于人類和其他動物疾病的治療和預防工作中［11－13］.在中華鱉疾病防治過程中，利用溫和氣單胞菌制成的微球緩釋疫苗免疫中華鱉后，免疫效果明顯高于滅活菌液注射組［14］.如前所述，Ah是中華鱉養殖中最常見、危害最嚴重的一種病原菌，但迄今尚未見到其緩釋疫苗應用于中華鱉免疫防治的研究報道.本實驗將滅活Ah制成微球緩釋疫苗，采用灌胃法對中華鱉進行口服免疫防治，同時與注射法比較，對其免疫應答進行了研究，并進行攻毒實驗研究其免疫保護率，旨在探索中華鱉Ah病的免疫防治新途徑，為中華鱉細菌性疾病防治研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 滅活菌液的制備

自河北省阜平縣中華鱉養殖水體取水樣，氨芐青霉素麥康凱瓊脂基礎培養基分離Ah，液體培養基培養24h，經菌落、菌體形態鑒定、生理生化特征分析及16SrDNA 分析等將其鑒定為Ah.采用倍比稀釋法測定菌懸液中的細菌質量濃度.擴大培養后的原菌液用體積分數0.2%甲醛滅活，將滅活的菌液涂于瓊脂基礎培養基，37 ℃培養24h，觀察是否有菌落生成，以判斷菌體滅活效果.

1.2 緩釋微球的制備、包封及體外釋放情況的測定

1.2.1 復乳化－溶劑揮發法制備緩釋微球疫苗

精確稱取1.2g聚乳酸－羥基乙酸共聚物（PLGA）加入到10mL二氯甲烷中使其完全溶解，然后再緩慢滴加滅活原菌液2mL，超聲波乳化1min，以便菌液與PLGA 充分混合，將乳化液加入到體積分數為2%的聚乙烯醇（PVA）溶液中，不斷高速攪拌2min，轉至低速慢攪6h直至二氯甲烷完全揮發，用蒸餾水洗3次，真空冷凍干燥［15］后即可得到制備好的緩釋微球.

1.2.2 緩釋微球包封情況的測定

首先將滅活菌液稀釋至1×106／mL，再依次進行10倍梯度稀釋直至1×102／mL，得到6種不同濃度的菌液，1 200r／min離心10min，取沉淀用蒸餾水溶解分散，采用722分光光度計（上海凌光技術有限公司）測定400nm 波長處的OD 值，根據所測OD 值繪制標準曲線，得出不同濃度菌液的細菌數與OD 值之間的線性關系即線性回歸方程.同時，將制備好的微球溶于CH2Cl2離心，沉淀用蒸餾水溶解后測OD 值.根據上述的線性回歸方程計算菌濃度.

1.2.3 緩釋微球體外釋放

稱取20份0.1g的微球，分別懸浮于蒸餾水中.為了檢測緩釋微球在體外的釋放情況，每隔2d隨機抽取其中1份微球懸浮液，干燥稱重，計算出干燥后的微球質量與原微球質量之比，得到在不同時間緩釋微球的體外釋放比例.

1.3 血液免疫指標測定

1.3.1 實驗準備

自保定徐水茂田中華鱉養殖場購得中華鱉，體質量為150～200g，馴養7d.選擇體表無明顯癥狀、活力強的個體96只隨機分成4組，1個對照組和3個實驗組，每組共24只，對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ采用灌胃方式給予微球疫苗，每只中華鱉給予的劑量依次為0，0.05，0.1g，實驗組Ⅲ采用后肢注射方式每只鱉給予滅活的原菌液0.1mL.在免疫后的0，7，14，21，30，40d，每組隨機挑取中華鱉4只，斷頸采血，利用肝素抗凝，用以檢測血清抗體效價、白細胞吞噬率和白細胞吞噬指數及淋巴細胞轉化率.

1.3.2 血清抗體效價的測定（平板凝集法）

利用制備的抗凝血靜置直至血細胞與血清分離，取血清進行2倍系列稀釋.分別取不同稀釋倍數的血清50μL滴于潔凈載玻片上，再在血清附近加入Ah凝集抗原，用消毒牙簽輕輕攪動使二者混合均勻，30 ℃孵育3min，光學顯微鏡下觀察并記錄免疫效果.

1.3.3 白細胞吞噬率和白細胞吞噬指數測定

分別取150μL抗凝血和150μL滅活的金黃色葡萄球菌液加入到1.5mL 離心管中，混勻，37 ℃溫育30min（每隔10min輕搖1次），然后取混合液涂片，置吉姆薩染液中30min，蒸餾水洗滌后，在100×油鏡下隨機挑取100個中性粒細胞，記錄吞噬細菌的細胞個數及吞噬的細菌數目.計算出吞噬細菌的細胞個數與細胞總數的百分比及吞噬的細菌總數與細胞總數的百分比即為吞噬率及吞噬指數［16］.

1.3.4 淋巴細胞轉化率的測定

在試管中將滅菌的質量質量濃度為30g／L的明膠溶液與抗凝血以體積比1:3混合，37℃水浴（試管30°傾斜放置）至大部分紅細胞下沉時，取上清液1 500r／min 離心10～15 min，沉淀用培養液稀釋分裝于1.5mL Eppendorf管中，每管分裝1mL作為培養用.1次實驗分裝2管，其中1管加植物血凝素（PHA－P），終濃度為50U／mL，另管作對照.置于37 ℃溫箱培養72h（每天旋轉搖勻2次）.取出后1 000r／min離心10min，沉淀用毛細滴管吹打分散均勻，涂片，置吉姆薩染液中染色30min，蒸餾水洗滌后，在100×油鏡下隨機挑取200個細胞進行觀察.淋巴細胞轉化率的公式如下［16］：

淋巴細胞轉化率＝（200個淋巴細胞中轉化的淋巴細胞數／200個淋巴細胞）×100%.

1.4 攻毒實驗

1.4.1 菌種毒力與攻毒劑量的確定

將Ah接種于AHM 固定培養基中培養24h，挑取單菌落接種于10mL TSB 液體培養基中，在恒溫振蕩器中28 ℃條件下振蕩培養過夜，次日取菌液按1:50體積比接種到20mL新鮮的TSB培養基中，振蕩培養20h，滅菌的生理鹽水洗2次后再用生理鹽水懸浮菌體至1.35×1010／mL，肌肉注射中華鱉，注射劑量為0.1mL／只，觀察并記錄中華鱉的發病和死亡情況.當菌種可以用作攻毒實驗時，對菌體懸浮液以10的倍數進行倍比稀釋接種中華鱉，記錄中華鱉的死亡數量，能致接種的中華鱉全部死亡的最小濃度即為最小致死濃度，此濃度可作為攻毒劑量.

1.4.2 疫苗對中華鱉攻毒的免疫保護作用

取經過馴養7d體質量為150 ～200g健康中華鱉60只，平均分成3組，每組20只.第1組每只注射濃度為1.35×108／mL 的菌懸液0.1 mL，第2 組采用灌胃方式每只給予緩釋微球疫苗0.1g，同時以每只0.1mL生理鹽水作為對照組，21d后采用1.4.1中的最小致死濃度對中華鱉進行攻毒實驗，觀察并記錄中華鱉的死亡和存活數量，計算免疫組存活率與對照組死亡率之比，得出不同免疫方式的免疫保護率.

1.5 數據分析

采用IBM SPSS Statistics 19.0統計軟件中的單因素方差分析（One－Way ANOVA）對數據進行顯著性檢驗.首先進行齊性分析，再采用LSD 進行多重比較.當P＜0.05被認為差異顯著.

2 結果與分析

2.1 微球疫苗的制備、包封及體外釋放情況

圖1 微球的體外釋放曲線Fig.1 Curve of microspheres in vitro release

培養所得菌液含細菌1.35×1011／mL，用體積分數為0.2%的甲醛28 ℃滅活48h，接種于AHM 固體培養基，28 ℃培養24h后沒有觀察到菌落生成.

制備的微球疫苗呈規則球形，表面完整，流動性好，粒徑大小均一，且粒徑小于50μm.根據菌液濃度與OD 值做標準曲線并得到線性回歸方程y＝3×10－12x＋0.000 4，根據回歸方程計算出微球含滅活菌約為6.75×1010／g.

通過對制備的緩釋微球疫苗體外釋放速度檢測微球的包封效果，實驗結果顯示：微球的釋放持續時間共接近40d，快速釋放發生在前14d，釋放比例達到了60%，隨后微球的釋放速度緩慢下降（圖1）.

2.2 中華鱉口服緩釋疫苗及注射疫苗后的免疫應答反應

凝集實驗結果顯示，實驗起始時各組的中華鱉血清抗體效價都比較低，且各組之間的差異不顯著（P＞0.05）.隨著免疫時間的延長，口服免疫微球疫苗的實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ和注射滅活菌組（實驗組Ⅲ）中華鱉的血清抗體效價均呈上升趨勢，并且從第7d 開始，各實驗組的抗體效價顯著高于對照組（P＜0.05），實驗組Ⅲ在第21d時血清效價達到最高點，實驗組Ⅰ（給予0.05g微球疫苗組）與實驗組Ⅱ（給予0.1g微球疫苗組）在第30d達到最高點.實驗前30d實驗組Ⅱ與實驗組Ⅲ相比，中華鱉的血清抗體效價之間的差異不顯著（P＞0.05），當免疫持續到第40d時，實驗組Ⅱ中華鱉的血清抗體效價顯著高于實驗組Ⅲ（P＜0.05）（圖2）.血清抗體效價結果表明，注射組與口服微球組均可顯著提高血清效價，其中口服0.1g緩釋疫苗組與注射組相比，持續時間較長，在40d時效價高于注射組.

圖2 注射免疫和口服微球緩釋疫苗后中華鱉的血清抗體效價Fig.2 Serum antibody titer of Pelodiscus sinensis after immunization by injection or oral administration

白細胞吞噬率如圖3所示，實驗起始時中華鱉白細胞吞噬率各組之間的差異不顯著（P＞0.05）.隨著免疫時間的延長，口服緩釋疫苗的2個組（實驗組Ⅰ和實驗組Ⅱ）和注射滅活菌的組（實驗組Ⅲ）中華鱉的白細胞吞噬率均呈上升趨勢，注射滅活菌的實驗組在第21d達到最高點，口服0.05g緩釋疫苗組（實驗組Ⅰ）與口服0.1g緩釋疫苗組（實驗組Ⅱ）在第30d達到最高點.免疫開始第7d時，口服0.1g緩釋疫苗組和注射滅活菌組中華鱉白細胞吞噬率明顯高于對照組（P＜0.05），但這2個實驗組之間沒有顯著差異（P＞0.05）.免疫開始第14d時，3個實驗組的白細胞吞噬率都明顯高于對照組（P＜0.05），且注射滅活菌組明顯高于2個口服緩釋疫苗組（P＜0.05）.當免疫第21，30，40d時，3個實驗組白細胞吞噬率均顯著高于對照組（P＜0.05），注射滅活菌組與口服0.1g緩釋疫苗組無顯著差異（P＞0.05），但到第30d和40d時，口服0.1g緩釋疫苗組的白細胞吞噬率都略高于注射組.結果表明，注射組與口服微球組均可造成白細胞吞噬率顯著上升，其中口服0.1g緩釋疫苗組與注射組效果相當，但從40d 的免疫應答效果看，口服0.1g緩釋疫苗組好于注射組.

圖3 注射免疫和口服微球緩釋疫苗后中華鱉的白細胞吞噬率Fig.3 Leucocyte phagocytic rate of Pelodiscus sinensis after immunization by injection or oral administration

白細胞吞噬指數結果如圖4所示，在實驗周期（40d）內，口服0.05g緩釋疫苗組（實驗組Ⅰ）和口服0.1g緩釋疫苗組（實驗組Ⅱ）中華鱉的白細胞吞噬指數隨著免疫時間的延長呈上升趨勢，在第30d達到最高點；注射組在前21d，白細胞吞噬指數呈上升趨勢，在第21d達到最高點，第30d和第40d逐漸下降.免疫第0d和第7d時，白細胞吞噬指數各組之間相比，差異不顯著（P＞0.05）.免疫14d時取材發現，口服0.1g緩釋疫苗組和注射滅活菌組中華鱉白細胞吞噬率明顯高于對照組（P＜0.05），但這2個實驗組之間沒有顯著差異（P＞0.05）.免疫第21d時，注射組的白細胞吞噬指數明顯高于2個口服緩釋疫苗組，但在第30d和第40d時，口服0.1g緩釋疫苗組的白細胞吞噬指數已明顯高于注射組（P＜0.05）.結果表明，注射組與口服微球組均可造成白細胞吞噬指數顯著上升，實驗結束時（40d）口服0.1g組效果最好，口服0.05g組和注射組效果相當.

圖4 注射免疫和口服微球緩釋疫苗后中華鱉的白細胞吞噬指數Fig.4 Leucocyte phagocytic index of Pelodiscus sinensis after immunization by injection or oral administration

淋巴細胞轉化率結果如圖5所示，實驗起始時，各個實驗組之間以及實驗組和對照組之間中華鱉淋巴細胞轉化率沒有顯著差異（P＞0.05）.隨著免疫時間的延長，對照組的淋巴細胞轉化率沒有明顯變化，3 個實驗組無論是口服不同劑量微球組還是注射組，淋巴細胞轉化率均呈上升趨勢，并且都在第30d時達到最高點.免疫第7d時，口服0.05g緩釋疫苗組（實驗組Ⅰ）與對照組沒有顯著差異（P＞0.05），口服0.1g緩釋疫苗組（實驗組Ⅱ）和注射組（實驗組Ⅲ）與對照組相比差異顯著（P＜0.05），但這2個實驗組之間沒有顯著差異（P＞0.05）.免疫第14d和21d時，3個實驗組的淋巴細胞轉化率均顯著高于對照組（P＜0.05），口服0.1g緩釋疫苗組和注射組之間無顯著差異（P＞0.05）.免疫第30d時，口服0.1g緩釋疫苗組和注射組淋巴細胞轉化率雖然均明顯高于對照組（P＜0.05），但這2個實驗組之間仍然沒有顯著差異（P＞0.05）.免疫第40d時，3個實驗組中華鱉的淋巴細胞轉化率均明顯高于對照組（P＜0.05），且口服0.1g緩釋疫苗組顯著高于注射組（P＜0.05）.結果表明，注射組與口服微球組后淋巴細胞轉化率顯著升高，14，21，30d時口服0.1g組和注射組相當，顯著高于對照組和口服0.05g組，40d口服0.1g組效果最好.

圖5 注射免疫和口服微球緩釋疫苗后中華鱉的淋巴細胞轉化率Fig.5 Lymphocyte transformation rate of Pelodiscus sinensis after immunization by injection or oral administration

2.3 攻毒后的免疫保護率

中華鱉采用不同免疫方式免疫21d后，用毒力菌株對中華鱉進行攻毒，攻毒劑量為1.35×107／只，檢測不同免疫方式對中華鱉的免疫保護率，結果顯示，無論是口服0.1g緩釋疫苗組還是注射滅活菌疫苗組，攻毒后死亡率僅有15%，而對照組死亡率為100%，推算出注射疫苗組和緩釋疫苗組免疫保護率均為85%（表1）.結果表明2種免疫方式均起到了良好的保護效果.

表1 注射免疫和口服微球緩釋疫苗后中華鱉的免疫保護率Tab.1 Immune protection rate of Pelodiscus sinensis after immunization by injection or oral administration

3 討論

中華鱉是我國淡水養殖的重要經濟種類，但在人工養殖過程中大量疾病的出現，大大制約了養鱉業的發展，其中Ah常常引發一系列嚴重的疾病.虞蘊如［3］等對罹患紅脖子病、紅底板病的中華鱉進行研究，發現病原為Ah.葉巧真［4］等研究發現Ah可以導致中華鱉罹患白底板病和紅底板病.儲衛華和楊金先［5］從人工養殖患有“腐皮病”的中華鱉肝臟中分離出菌株BH－1，人工回染健康鱉，患病率為100%，經鑒定致病菌為Ah.

采用疫苗免疫中華鱉是解決這一問題的有效途徑之一.在Ah疫苗方面，多數直接利用滅活疫苗進行注射免疫，但是在實施過程中工作量大，易造成鱉體注射傷口感染，還易引起機體的應激反應.浸浴是另一種常用方式，但僅適用于稚鱉，或作為注射疫苗的輔助方式，其免疫效果不夠理想［17］.本實驗中，采用PLGA 包裹滅活菌制成緩釋微球疫苗，在鱉體內釋放時間較長，近40d.這與錢明明等［18］報道的釋放時間較長相一致.

血清凝集抗體效價、白細胞吞噬率、白細胞吞噬指數和淋巴細胞轉化率經常用于評價免疫效果的方法.以往的研究顯示，用Ah（T3菌）滅活疫苗免疫中華鱉，血清凝集抗體效價顯著提高［19］；從中華鱉的病原菌如Ah等提取細胞壁組分——脂多糖，對其注射免疫，血清凝集抗體及交叉凝集抗體效價顯著提高，吞噬細胞的吞噬活力（以吞噬率和吞噬指數為評價指標）顯著提高，對Ah活菌的殺菌活性也顯著上升［20］.

在免疫應答實驗后期，口服緩釋疫苗組的各免疫應答指標均顯著高于對照組，這證明了微球緩釋疫苗的有效性.孫紅祥等［14］報道，中華鱉口服溫和氣單胞菌微球疫苗后血清凝集抗體效價和白細胞殺菌百分率可達到滅活菌液注射組的效果，顯著高于對照組.本實驗中，實驗前30d口服0.1g／只微球疫苗免疫中華鱉可以達到注射滅活疫苗的效果.30d 后，注射免疫的效果開始下降，而口服免疫效果還可繼續維持，除白細胞吞噬率外其余3項免疫應答指標均顯著高于注射免疫組（P＜0.05），原因可能是滅活疫苗被包被在微球內部，疫苗在進入中華鱉消化道內被緩慢釋放，能持續刺激鱉體，導致免疫應答的持續效果優于注射免疫.

本實驗選用了2種劑量的微球疫苗對中華鱉免疫.免疫應答指標結果顯示，當劑量為0.05g／只時，雖然免疫效果好于對照組，但多數免疫指標低于劑量較高的口服免疫組，說明口服免疫效果的發揮與選擇的劑量密切相關.因此在攻毒實驗中，采用劑量為0.1g／只進行口服免疫.至于0.1g／只是否為最優劑量，有待進一步的實驗確定.

4 結論

采用復乳化－溶劑揮發法制備緩釋微球疫苗，通過灌胃方式免疫中華鱉.以血清抗體效價等免疫應答指標的免疫應答效果與注射免疫組相當，體外釋放可持續近40d，證明了緩釋微球疫苗免疫的持續性.攻毒實驗證明注射免疫方式和口服微球免疫方式的免疫保護率相同，證明了該疫苗的有效性.結合免疫應答和攻毒實驗結果，認為該方法可作為控制中華鱉Ah病的一種免疫防治新途徑.

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